工程菌的高效表达和稳定性.ppt

工程菌的高效表达和稳定性工程菌工程菌简介介 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称胞株系一般称为“工程菌工程菌”。工程菌的高效表达基因工程的最基因工程的最终目的是在一个合适的系目的是在一个合适的系统中，中，使外源基因高效表达，从而生使外源基因高效表达，从而生产有价有价值的蛋白的蛋白质产品。表达系品。表达系统有原核系有原核系统和真核系和真核系统。原核生物基因表达的特点：原核生物基因表达的特点：（1）原核生物只有一种原核生物只有一种RNA聚合聚合酶，识别原核原核的启的启动子，催化所有子，催化所有RNA合成。合成。（2）原核生物的基因表达是以操原核生物的基因表达是以操纵子子为单位。操位。操纵子是数个相关的子是数个相关的结构基因及其构基因及其调控区的控区的结合，是合，是一个基因表达的一个基因表达的协同同单位。位。（3）由于原核生物无核膜，所以由于原核生物无核膜，所以转录与翻与翻译是耦是耦联的，二者也是的，二者也是连续进行的。原核生物染色体行的。原核生物染色体DNA是裸露的是裸露的环型型DNA，转录成成mRNA后，可直接在后，可直接在胞胞浆中与核糖体中与核糖体结合翻合翻译成蛋白成蛋白质。每个核糖体可。每个核糖体可独立完成一条独立完成一条链的合成，多核糖体可同的合成，多核糖体可同时在在1条条mRNA合成多条合成多条肽链，大大提高了翻，大大提高了翻译效率。效率。（4）原核基因不含内含子（原核基因不含内含子（intron），没有），没有转录后加工后加工过程。程。（5）原核生物基因表达的控制主要是在原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。水平。对RNA合成的合成的调控有两种方式：启始控制（启控有两种方式：启始控制（启动子子控制）和控制）和终止控制（衰减子控制）。止控制（衰减子控制）。（6）在大在大肠杆菌杆菌mRNA的核糖体的核糖体结合位点上，有合位点上，有一个一个转译启始密启始密码子及同子及同16S核糖体核糖体RNA3末端末端碱基互碱基互补的序列，即的序列，即SD序列，真核基因序列，真核基因则无此序列。无此序列。外源基因在原核中表达的关外源基因在原核中表达的关键：（1）通通过表达表达载体将外源基因体将外源基因导入宿主菌，并指入宿主菌，并指导宿主菌的宿主菌的酶系系统合成外源蛋白；合成外源蛋白；（2）外源基因不能外源基因不能带有有intron；（3）利用原核利用原核细胞的胞的强启启动子和子和SD序列等控制外序列等控制外源基因的表达；源基因的表达；（4）外援基因与表达外援基因与表达载体体连接后，必接后，必须形成正确形成正确的开放的开放阅读框架；框架；（5）利用宿主菌的利用宿主菌的调控系控系统，调节外源基因的表外源基因的表达，防止表达的外源基因达，防止表达的外源基因产物物对宿主菌的毒害。宿主菌的毒害。外源基因在真核外源基因在真核细胞中的表达胞中的表达哺乳哺乳动物物细胞做宿主表达体系的胞做宿主表达体系的优点：点：（1）能能识别和除去外源基因中的内含子，剪和除去外源基因中的内含子，剪切加工成成熟的切加工成成熟的mRNA；（2）表达的蛋白表达的蛋白质在翻在翻译后被加工的机会多后被加工的机会多（如糖基化），更接近于体内构型；（如糖基化），更接近于体内构型；（3）易被重易被重组DNA转染，具有染，具有遗传稳定性和定性和可重复性；可重复性；（4）经转化的哺乳化的哺乳动物物细胞可将表达的胞可将表达的产物物分泌到培养基中，提分泌到培养基中，提纯工工艺简单，成本低。，成本低。影响工程菌发酵的原因对发酵影响酵影响较大的几个因素有：大的几个因素有：培养基的影响；接种量的影响；温度的影响；培养基的影响；接种量的影响；温度的影响；溶解氧的影响；溶解氧的影响；诱导时机的影响；机的影响；诱导表达程表达程序的影响；序的影响；pH的影响。的影响。1.培养基的影响培养基的影响培养基的培养基的组成既要提高工程菌的生成既要提高工程菌的生长速率，又速率，又要保持工程菌的要保持工程菌的稳定性，从而使外源基因高效定性，从而使外源基因高效表达。表达。2.接种量的影响接种量的影响接种量的大小影响接种量的大小影响发酵的酵的产量和量和发酵周期。接酵周期。接种量小，菌体延种量小，菌体延迟期期较长，使菌，使菌龄老化，不利老化，不利于外源基因表达；接种量大，可于外源基因表达；接种量大，可缩短生短生长延延迟期，菌体迅速繁衍，很快期，菌体迅速繁衍，很快进入入对数生数生长期，适期，适于表达外源基因；接种量于表达外源基因；接种量过高，使菌体生高，使菌体生长过快，代快，代谢物物积累累过多，反而会抑制后期菌体的多，反而会抑制后期菌体的生生长。3.温度的影响温度的影响温度温度对发酵酵过程的影响是多方面的。它影响各程的影响是多方面的。它影响各种种酶的反的反应速度，改速度，改变菌体代菌体代谢产物的反物的反应方方向，影响代向，影响代谢调控机制。适宜的控机制。适宜的发酵温度是既酵温度是既适合菌体的生适合菌体的生长，又适合代，又适合代谢产物合成的温度物合成的温度。高温或低温都会使。高温或低温都会使发酵异常，影响酵异常，影响终产物的物的形成并形成并导致减致减产。温度。温度还影响蛋白影响蛋白质的活性和的活性和包含体的形成。包含体的形成。4.溶解氧的影响溶解氧的影响对于好氧于好氧发酵酵,溶解氧溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高能提高发酵酵产率。率。发酵酵时，随溶解氧，随溶解氧浓度的下降，度的下降，细胞生胞生长减慢，减慢，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高胞的呼吸作用，提高对氧的需求。氧的需求。维持持较高高的溶解氧的溶解氧值，才能提高工程菌的生，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白，利于外源蛋白产物的形物的形成。采用成。采用调节搅拌拌转速的方法速的方法,可改可改变培养培养过程中的氧供程中的氧供给，提，提高活菌高活菌产量。量。5.pH的影响的影响根据工程菌的生根据工程菌的生长和代和代谢情况，情况，对pH进行适当行适当的的调节。如采取两段培养工。如采取两段培养工艺，培养前期重点，培养前期重点是是优化工程菌的生化工程菌的生长条件，培养后期重点是条件，培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件。化外源蛋白的表达条件。6.诱导时机的影响机的影响一般在一般在对数生数生长期或期或对数生数生长后期升温后期升温诱导表表达。在达。在对数生数生长期，期，细胞快速繁殖，胞快速繁殖，这时菌体菌体数目倍增，数目倍增，对营养和氧需求量急增，养和氧需求量急增，营养和氧养和氧成了菌群旺盛代成了菌群旺盛代谢的限制因素。的限制因素。7.诱导表达程序的影响表达程序的影响热诱导的程序提高外源蛋白表达量。的程序提高外源蛋白表达量。基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：质粒不稳定可分为：分裂不稳定分裂不稳定 结构不稳定结构不稳定分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变导致质粒不稳定的导致质粒不稳定的常见的三个因素：常见的三个因素：常见的三个因素：常见的三个因素：1.1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；2.2.这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小;3.3.插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构。对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；数可提高稳定性；数可提高稳定性；数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法样品样品样品样品不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素 平平平平 板板板板 培培培培 养基养基养基养基10-12h10-12h10-12h10-12h100100100100个菌落个菌落个菌落个菌落含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素平平平平 板板板板 培培培培 养养养养 基基基基 10-12h10-12h10-12h10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次重复三次重复三次,计算比值计算比值计算比值计算比值 (稳定性稳定性稳定性稳定性stability)stability)stability)stability)提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法1.1.选择合适宿主菌选择合适宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。因同源序列等都会影响质粒的稳定性。2.选择合适的合适的载体体 改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略。不同的目的采取不同的策略。3.选择压力力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。细胞才能够生长。4.4.分段控制培养分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。高，重组质粒往往越不稳定。可采用可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。5.5.控制培养条件控制培养条件 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键关键 步骤。步骤。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3 3个方面尤其个方面尤其重要。重要。1）培养基的）培养基的组成成培养基对克隆菌稳定性的影响培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型PBB PBB W3110trpAE1trpR tnaAW3110trpAE1trpR tnaA 7%7%结构性结构性MM MM (RSF 2124-trp)(RSF 2124-trp)99%99%结构性结构性PBB PBB W3110 trpAE1 trpRam27 W3110 trpAE1 trpRam27 12%12%分配性分配性MM MM (pSC101-trp)(pSC101-trp)48%48%分配性分配性2 2）培养温度）培养温度 对于温度敏感性于温度敏感性质粒，粒，为了控制在生了控制在生长前期其外源基因不表达，一般采用二前期其外源基因不表达，一般采用二阶段温度培养系段温度培养系统，即在菌种生，即在菌种生长阶段，采用段，采用较低的培养温度，当菌体生低的培养温度，当菌体生长至适至适宜宜浓度和生度和生长时期期时，提高温度，提高温度进行行诱导，使外源基因表达。重，使外源基因表达。重组工程菌的生工程菌的生长和和产物合成物合成时的的PH往往不同往往不同。3 3）菌体比生长速率）菌体比生长速率 比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。并可能与克隆菌本身和培养条件有关。例如例如:在酵母系统中，在酵母系统中，大则质粒大则质粒pJDB248pJDB248稳定性稳定性高。高。如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但很难达到。在某些情况下，重组质粒的稳定性。但很难达到。在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降低低值，提高重组质粒的稳定性。值，提高重组质粒的稳定性。比生长速率比生长速率为表征微生物生长速率的一个参数,其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。推算过程：假定在任何时间（t），微生物细胞数目的增长速率（dN/dt）正比于已经存在的总细胞数目（N），则得：dN/dt=N。经积分得：lnNt-lnN0=t，对于一倍增时间，t=td,Nt=2N0的培养物：ln2N0-lnN0=td。易得：=ln2/td。参数含义：比生长速率，单位h-1 t时间，单位h N任何时间处微生物细胞量 Nt开始培养t时间过后生物细胞量 N0开始时微生物细胞量 td倍增时间，即为微生物细胞量变为原来的两倍所需的时间6.6.固定化固定化 固定化技固定化技术包括固定化包括固定化酶技技术与固定化微生物技与固定化微生物技术。固定化微生物技。固定化微生物技术是用化学是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域区域,以提高微生物以提高微生物细胞的胞的浓度度,使其使其保持保持较高的生物活性并反复利用的方法。高的生物活性并反复利用的方法。良好固定化细胞方法的条件：1 1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度；）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度；2 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；3 3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pHpH值和温值和温度下，不会被破坏；度下，不会被破坏；4 4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性；械稳定性和化学稳定性；5 5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应；因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应；6 6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。固定化细胞的制备方法常用的有常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中等，其中包埋法最为普遍。包埋法最为普遍。