生物化学第四章蛋白质的共价结构.ppt

第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构一、蛋白质通论一、蛋白质通论二、肽二、肽三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能五、肽与蛋白质的人工合成五、肽与蛋白质的人工合成2005-12-142005-12-14一、蛋白质通论一、蛋白质通论蛋蛋白白质质(Protein)(Protein)是是生生物物体体的的基基本本组组成成成成份份。在在人人体体内内蛋蛋白白质质的的含含量量很很多多，约约占占人人体体固固体体成成分分的的45%45%，它它的的分分布布很很广广，几几乎乎所所有有的的器器官官组组织织都都含含蛋蛋白白质质，并并且且它它又又与与所所有有的的生生命命活活动密切联系。动密切联系。机机体体新新陈陈代代谢谢过过程程中中的的一一系系列列化化学学反反应应几几乎乎都都依依赖赖于于生生物物催催化化剂剂酶酶的的作作用用，而而酶酶的的本本质质就就是是蛋蛋白白质质；调调节节物物质质代代谢谢的的激激素素有有许许多多也也是是蛋蛋白白质质或或它它的的衍衍生生物物；其其它它诸诸如如肌肌肉肉的的收收缩缩，血血液液的的凝凝固固，免免疫疫功功能能，组组织织修修复复以以及及生生长长、繁繁殖殖等等主主要要功功能能无无一一不不与与蛋蛋白白质质相相关关。近近代代分分子子生生物物学学的的研研究究表表明明，蛋蛋白白质质在在遗遗传传信信息息的的控控制制、细细胞胞膜膜的的通通透透性性、神神经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。2005-12-142005-12-14（一）蛋白质的化学组成和分类（一）蛋白质的化学组成和分类单单纯纯蛋蛋白白质质的的元元素素组组成成为为C C 505055%55%、H H 6%6%7%7%、O O 19%19%24%24%、N N 13%13%19%19%，除除此此之之外外还还有有S S 0 04%4%。有有的的蛋蛋白白质质含含有有P P、I I。少数含少数含FeFe、CuCu、ZnZn、MnMn、CoCo、MoMo等金属元素。等金属元素。各各种种蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量很很接接近近，平平均均为为16%16%。由由于于体体内内组组织织的的主主要要含含氮氮物物是是蛋蛋白白质质，因因此此，只只要要测测定定生生物物样样品品中中的的氮氮含含量量，就就可以按下式推算出蛋白质大致含量：可以按下式推算出蛋白质大致含量：蛋白质含量蛋白氮蛋白质含量蛋白氮 （凯氏（凯氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法的计算基础）定氮法的计算基础）2005-12-142005-12-14单单纯纯蛋蛋白白质质（simple simple protein)protein)：仅仅由由氨氨基基酸酸组组成成，不不含其它化学成分。含其它化学成分。缀缀合合蛋蛋白白质质(conjugated(conjugated protein)protein)：除除含含有有氨氨基基酸酸外外的的各各种种化化学学成成分分作作为为其其结结构构的的一一部部分分。非非蛋蛋白白质质部部分分称为称为辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)或或配体配体(ligand)(ligand)。单纯蛋白质单纯蛋白质 （按溶解度分类）（按溶解度分类）清蛋白清蛋白球蛋白球蛋白谷蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白谷醇溶蛋白组蛋白组蛋白鱼精蛋白鱼精蛋白硬蛋白硬蛋白 缀合蛋白质缀合蛋白质 （按非氨基酸（按非氨基酸 成分分类）成分分类）糖蛋白糖蛋白脂蛋白脂蛋白核蛋白核蛋白磷蛋白磷蛋白金属蛋白金属蛋白血红素蛋白血红素蛋白黄素蛋白黄素蛋白组组成成2005-12-142005-12-14单纯蛋白质分类单纯蛋白质分类2005-12-142005-12-14结合蛋白质分类结合蛋白质分类2005-12-142005-12-14 蛋白质蛋白质（按生物学功能分类）（按生物学功能分类）酶酶调节蛋白调节蛋白转运蛋白转运蛋白贮存蛋白贮存蛋白收缩和游动蛋白收缩和游动蛋白结构蛋白结构蛋白支架蛋白支架蛋白保护和开发蛋白保护和开发蛋白异常蛋白异常蛋白2005-12-142005-12-14（二）蛋白质的形状和大小（二）蛋白质的形状和大小形状形状纤维状纤维状球状球状膜蛋白膜蛋白球状蛋白质球状蛋白质globular proteinglobular protein 分子对称性佳，外形接分子对称性佳，外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。属于这一类。Eg.Eg.血红蛋白、血清球蛋白。血红蛋白、血清球蛋白。纤维状蛋白质纤维状蛋白质fibrous proteinfibrous protein 对称性差，分子类似纤对称性差，分子类似纤维或细棒。它又可分为维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质可溶性纤维状蛋白质肌球蛋白。肌球蛋白。和不溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质胶原、弹性蛋白胶原、弹性蛋白 膜蛋白质膜蛋白质membrane proteinmembrane protein细胞的各种膜系统结合而存细胞的各种膜系统结合而存在，与膜内的非极性相相互作用，疏水侧链伸向外侧，亲水在，与膜内的非极性相相互作用，疏水侧链伸向外侧，亲水氨基酸残基较胞质少。氨基酸残基较胞质少。2005-12-142005-12-14分子大小分子大小蛋白质的相对分子量从大约蛋白质的相对分子量从大约600060001101106 6或更大一些。或更大一些。单单体体蛋蛋白白质质(monomeric(monomeric protein)protein)：仅仅由由一一条条多多肽肽链链组组成成。其相对分子量除以其相对分子量除以110110估计氨基酸残基的数目。估计氨基酸残基的数目。寡寡聚聚蛋蛋白白质质(oligomeric(oligomeric protein)protein)：由由两两条条或或多多条条多多肽肽链链组组成。每条多肽链称为亚基成。每条多肽链称为亚基(subunit)(subunit)。多酶体系多酶体系2005-12-142005-12-14l蛋白质分子量的上下蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子这决定于蛋白质和分子量概念的定义。量概念的定义。l有些寡聚蛋白质的分有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至子量可高达数百万甚至数千万。数千万。2005-12-142005-12-14（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次一级结构一级结构(primary structure)(primary structure)：多肽链的氨基酸序列。多肽链的氨基酸序列。二二级级结结构构(secondary(secondary structure)structure)：多多肽肽链链中中主主链链原原子子的的局局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。三三级级结结构构(tertiary(tertiary structure)structure)：蛋蛋白白质质的的多多肽肽链链在在各各种种二二级级结结构构的的基基础础上上再再进进一一步步盘盘曲曲或或折折迭迭形形成成具具有有一一定定规规律律的的三三维空间结构。维空间结构。四四级级结结构构(quarternary(quarternary structure)structure)：具具有有二二条条或或二二条条以以上上独独立立三三级级结结构构的的多多肽肽链链组组成成的的蛋蛋白白质质，其其多多肽肽链链间间通通过过次次级级键相互组合而形成的空间结构。键相互组合而形成的空间结构。2005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142005-12-14四、蛋白质功能的多样性四、蛋白质功能的多样性 蛋蛋白白质质的的序序列列异异构构现现象象是是蛋蛋白白质质生生物物功功能能多多样样性性和和物物种种特异性的结构基础。特异性的结构基础。蛋白质的生物学功能：蛋白质的生物学功能：1.1.催化；催化；2.2.调节；调节；3.3.转运；转运；4.4.贮存；贮存；5.5.运动；运动；6.6.结构成分；结构成分；7.7.支架作用；支架作用；8.8.防御与进攻；防御与进攻；9.9.异常功能；异常功能；蛋蛋白白质质（proteinprotein）是是生生活活细细胞胞内内含含量量最最丰丰富富、功功能能最最复复杂杂的的生生物物大大分分子子，并并参参与与了了几几乎乎所所有有的的生生命命活活动动和和生生命命过过程程。因因此此，研研究究蛋蛋白白质质的的结结构构与与功功能能始始终终是是生生命命科科学学最最基基本本的命题。的命题。生生物物体体最最主主要要的的特特征征是是生生命命活活动动，而而蛋蛋白白质质是是生生命命活活动动的体现者，具有以下主要功能：的体现者，具有以下主要功能：2005-12-142005-12-14二、肽二、肽肽肽是是氨氨基基酸酸的的线线性性聚聚合合物物，常常称称多多肽肽链链（peptide peptide chainchain）。蛋蛋白白质质是是由由一一条条或或多多条条具具有有确确定定的的氨氨基基酸酸序序列列的的多多肽肽链链构构成成的大分子。的大分子。（一）肽和肽键的结构（一）肽和肽键的结构蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。2005-12-142005-12-14肽链写法肽链写法：游离：游离-氨基在左，游离氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。表示肽键。H2N-丝氨酸丝氨酸-缬氨酸缬氨酸-酪氨酸酪氨酸-天冬氨酸天冬氨酸-谷氨酰氨谷氨酰氨-COOHSer-Val-Tyr-Asp-Gln（S-V-Y-D-Q）2005-12-142005-12-14肽键肽键肽肽键键的的特特点点是是氮氮原原子子上上的的孤孤对对电电子子与与羰羰基基具具有有明显的共轭作用。明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。2005-12-142005-12-14由由于于羰羰基基碳碳-氧氧双双键键的的靠靠拢拢，允允许许存存在在共共振振结结构构（resonance resonance structurestructure），碳碳与与氮氮之之间间的的肽肽键键有有部部分分双双键键性性质质，由由CO-NHCO-NH构构成成的的肽肽单单元元呈呈现现相相对对的的刚刚性性和和平平面面化化，肽肽键键中中的的4 4个个原原子子和和它它相相邻邻的的两两个个-碳碳原原子子多多处处于于同同一一个个平平面面上。上。多肽链可以看成由多肽链可以看成由C C串联起来的无数个酰胺平面组成串联起来的无数个酰胺平面组成2005-12-142005-12-14肽键肽键肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双双键性质，不能自由旋转。键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式在大多数情况下，以反式结构存在。结构存在。2005-12-142005-12-14肽基的肽基的C、O和和N原子间的共振相互作用原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 肽键呈反式构型肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体2005-12-142005-12-14（二）肽的物理和化学性质（二）肽的物理和化学性质短短肽肽的的晶晶体体是是离离子子品品格格，在在水水溶溶液液中中以以偶偶极极离离子子存存在在。在在pH0-14pH0-14范围内，肽键中的亚氨基不能解离。范围内，肽键中的亚氨基不能解离。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。肽肽的的化化学学反反应应也也和和氨氨基基酸酸一一样样，游游离离的的氨氨基基、羧羧基基和和R R基基可可以以发发生生与与氨氨基基酸酸中中相相应应的的基基团团类类似似的的反反反反应应。双双缩缩脲脲反反应应是是肽肽和和蛋蛋白白质质所所特特有有的的，而而为为氨氨基基酸酸所所没没有有的的一一个颜色反应。个颜色反应。一一般般短短肽肽的的旋旋光光度度约约等等于于组组成成该该肽肽中中各各个个氨氨基基酸酸的的旋旋光光度度的的总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。2005-12-142005-12-14（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽生生物物体体内内游游离离存存在在着着很很多多活活性性肽肽，具具有有各各种种特特殊殊的的生生物物学功能。学功能。激素：脑啡肽、催产素、加压素、舒缓激肽激素：脑啡肽、催产素、加压素、舒缓激肽抗生素：短杆菌肽、多粘菌素抗生素：短杆菌肽、多粘菌素E E、放线菌素、放线菌素D D蕈的剧毒毒素：蕈的剧毒毒素：鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽鹅肌肽、肌肽鹅肌肽、肌肽天然肽中含有蛋白质中不存在的天然肽中含有蛋白质中不存在的-肽键、肽键、丙氨酸和丙氨酸和D D型氨基酸。型氨基酸。2005-12-142005-12-14脑啡肽脑啡肽Met-Met-脑啡肽脑啡肽 +H H3 3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-N-Tyr-Gly-Gly-Phe-MetMet-COO-COO-Leu-Leu-脑啡肽脑啡肽+H H3 3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-N-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuLeu-COO-COO-2005-12-142005-12-14牛催产素牛催产素 牛加压素牛加压素2005-12-142005-12-14环状八肽环状八肽鹅膏蕈属中的剧鹅膏蕈属中的剧毒毒素毒毒素2005-12-142005-12-14L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽)由由细细菌菌分分泌泌的的多多肽肽，有有时时也也都都含含有有D-D-氨氨基基酸酸和和一一些些不不常常见见氨氨基基酸酸，如如鸟鸟氨氨酸酸（Ornithine,Ornithine,缩写为缩写为 Orn Orn）。）。2005-12-142005-12-14三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。（一）蛋白质测序的策略（一）蛋白质测序的策略 (1)(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2)(2)拆分蛋白质分子的多肽链。拆分蛋白质分子的多肽链。(3)(3)测定多肽链的氨基酸组成。测定多肽链的氨基酸组成。(4)(4)分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端残基。末端残基。(5)(5)断裂多肽链内的二硫键。断裂多肽链内的二硫键。(6)(6)多肽链断裂成肽段。多肽链断裂成肽段。(7)(7)测定各个肽段的氨基酸顺序。测定各个肽段的氨基酸顺序。(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序。确定肽段在多肽链中的次序。(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。2005-12-142005-12-14将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质蛋白质顺序测定蛋白质顺序测定基本方法路线基本方法路线2005-12-142005-12-142005-12-142005-12-14（二）（二）N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定末端分析末端分析（1 1）DNFBDNFB法；法；（2 2）DNSDNS法法（3 3）PITCPITC法法（4 4）氨肽酶法）氨肽酶法末端分析末端分析（1 1）肼解法；）肼解法；（2 2）还原法）还原法（3 3）羧肽酶法）羧肽酶法2005-12-142005-12-14SangerSanger法法。2,4-2,4-二二硝硝基基氟氟苯苯在在碱碱性性条条件件下下，能能够够与与肽肽链链N-N-端端的的游游离离氨氨基基作作用用，生生成成二二硝硝基基苯苯衍衍生生物物（DNPDNP）。）。在在酸酸性性条条件件下下水水解解，得得到到黄黄色色DNP-DNP-氨氨基基酸酸。该该产产物物能能够够用用乙乙醚醚抽抽提提分分离离。不不同同的的DNP-DNP-氨氨基基酸酸可可以以用用色色谱法进行鉴定。谱法进行鉴定。N N 末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法2005-12-142005-12-14在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到以达到1 1 1010-9-9molmol。N N 末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定丹磺酰氯法丹磺酰氯法2005-12-142005-12-14氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为以亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。N N 末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定氨肽酶氨肽酶(amino peptidases)(amino peptidases)法法2005-12-142005-12-14此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。C C 末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定肼解法肼解法2005-12-142005-12-14此法是多肽链此法是多肽链C-C-末端氨基酸分析法。末端氨基酸分析法。多肽与多肽与LiBHLiBH4 4在无水条件下加热，在无水条件下加热，C-C-端端氨基酸被还原为醇即从肽链上解离出氨基酸被还原为醇即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则不变。醇很容易来，其余的氨基酸则不变。醇很容易与其余氨基酸分离。与其余氨基酸分离。C C 末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定LiBHLiBH4 4法法2005-12-142005-12-14羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解AAAA。根据不同的反应时间测。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。C C 末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定羧肽酶羧肽酶(carboxypeptidase)(carboxypeptidase)法法2005-12-142005-12-14（三）二硫桥的断裂（三）二硫桥的断裂断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。s ss sHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H H2005-12-142005-12-14S SS SS SS SS SS S胰岛素胰岛素HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH2005-12-142005-12-14作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。巯巯基基（-S SH H）的的保保护护2005-12-142005-12-14还可用碘乙酸还可用碘乙酸ICHICH2 2COOCOO-保护，保护，在多肽链中引入负电荷。亦可用在多肽链中引入负电荷。亦可用碘乙酰胺碘乙酰胺ICHICH2 2CONHCONH2 2 保护。保护。如用乙撑亚胺保护巯基，生成氨如用乙撑亚胺保护巯基，生成氨乙基半胱氨酸乙基半胱氨酸AECysAECys，在肽链中引，在肽链中引入胰蛋白酶的酶切位点。入胰蛋白酶的酶切位点。巯巯基基（-S SH H）的的保保护护2005-12-142005-12-14（四）氨基酸组（四）氨基酸组成的分析成的分析用用于于蛋蛋白白的的氨氨基基酸酸组组成成测测定定的的水水解解方方法法主主要要是是酸酸水水解解，同时辅以碱水解。同时辅以碱水解。氨基酸分析仪图谱氨基酸分析仪图谱2005-12-142005-12-14酸水解酸水解常常用用6 6 mol/Lmol/L的的盐盐酸酸或或4 4 mol/Lmol/L的的硫硫酸酸在在105-110105-110条条件件下下进进行行水水解解，反反应应时时间间约约2020小时。小时。此此法法的的优优点点是是不不容容易易引引起起水水解解产产物物的的消消旋旋化。缺点是化。缺点是色氨酸色氨酸被沸酸完全破坏；被沸酸完全破坏；含含有有羟羟基基的的氨氨基基酸酸如如丝丝氨氨酸酸或或苏苏氨氨酸酸有有一一小小部部分分被被分分解解；门门冬冬酰酰胺胺和和谷谷氨氨酰酰胺胺侧侧链链的酰胺基被水解成了羧基。的酰胺基被水解成了羧基。2005-12-142005-12-14碱水解碱水解一般用一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。小时。由由于于水水解解过过程程中中许许多多氨氨基基酸酸都都受受到到不不同同程程度的破坏，产率不高。度的破坏，产率不高。部分的水解部分的水解产物发生消旋化产物发生消旋化。主要用来测定色氨酸含量主要用来测定色氨酸含量2005-12-142005-12-14（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化纯化1.1.酶裂解法酶裂解法目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzymeproteolytic enzyme）或称蛋白酶）或称蛋白酶（proteinaseproteinase）已有十多种。如：）已有十多种。如：胰蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶应用酶水解多肽，不会破坏氨基酸，也不会发生消应用酶水解多肽，不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化，旋化，色氨酸色氨酸在水解中也不受破坏。水解的产物为在水解中也不受破坏。水解的产物为较小的较小的肽肽段。段。最常见的蛋白水解酶有以下几种：最常见的蛋白水解酶有以下几种：2005-12-142005-12-14胰胰 蛋蛋 白白 酶酶(trypsin)(trypsin)这这是是最最常常用用的的蛋蛋白白水水解解酶酶，专专一一性性强强，只只断断裂裂赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸的的羧羧基基参参与与形形成成的的肽肽键键。得得到到的的是是以以ArgArg或或LysLys为为C-C-末末端端残残基基的的肽肽段段，肽肽段段数数目目等等于于多多肽肽链链中中ArgArg和和LysLys总总数数加加1 1。2005-12-142005-12-14为为了了减减少少胰胰蛋蛋白白酶酶的的作作用用位位点点，可可以以通通过过化化学学修修饰饰将将其其侧侧链链基基因因保保护护起起来来。用用马马来来酸酸酐酐可可以以保保护护LysLys残残基基侧侧链链上上的的NHNH2 2，胰胰蛋蛋白白酶酶就就不不会会水水解解LysLys竣竣基基参参与与形形成成的的肽肽键键，只只能能断断裂裂ArgArg羧羧基基所所形形成成的的肽肽键键；反反之之，如如果果用用1 1，2 2环环己己二二酮酮修修饰饰ArgArg的胍基，则胰蛋白面只能裂解的胍基，则胰蛋白面只能裂解LysLys羧基所形成的肽键。羧基所形成的肽键。如如果果想想增增加加多多肽肽链链中中胰胰蛋蛋白白酶酶的的断断裂裂点点，可可以以用用丫丫丙丙啶啶处处理理多多肽肽链链样样品品，这这时时CysCys残残基基侧侧链链被被修修饰饰成成类类似似LysLys的的侧侧链链，也也具有具有NHNH2 2。这样胰蛋白酶便能断裂。这样胰蛋白酶便能断裂CysCys羧基端的肽键。羧基端的肽键。R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg侧链（专一性较强，水解速度快）。侧链（专一性较强，水解速度快）。R R2 2=Pro=Pro 水水解受抑。解受抑。2005-12-142005-12-14糜糜蛋蛋白白酶酶(chymotrypin)(chymotrypin)或或胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶(Chymotrypsin)Chymotrypsin)：它它断断裂裂PhePhe、TrpTrp和和TyrTyr等等疏疏水水氨氨基基酸酸的的羧羧基基参参与与形形成成的的肽肽键键。断断裂裂键键邻邻近近的的基基团团是是碱碱性性的的，裂裂解解能能力力增增加加；是是酸酸性性的的，裂裂解能力将减弱。解能力将减弱。肽链水解位点水解位点R R1 1=Phe,=Phe,Trp,TyrTrp,Tyr时时水水解解快快;R R1 1=LeuLeu，MetMet和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。2005-12-142005-12-14肽链水解位点水解位点胃胃蛋蛋白白酶酶(pepsin)(pepsin)它它要要求求被被断断裂裂键键两两侧侧的的残残基基都都是是疏疏水水性性氨氨基基酸酸，如如Phe-PhePhe-Phe。此此外外与与糜糜蛋蛋白白酶酶不不同同的的是是酶酶作作用用的的最最适适pHpH，前前者者是是pH2pH2，后后者者是是pH8-9pH8-9，由由于于二二硫硫键键在在酸酸性性条条件件下下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。R R1 1和和R R2 2Phe,Trp,Tyr;LeuPhe,Trp,Tyr;Leu以及以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。其它疏水性氨基酸水解速度较快。R R1 1=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。2005-12-142005-12-14肽链水解位点水解位点嗜热菌蛋白酶（嗜热菌蛋白酶（thermolysinthermolysin）:常用于断裂较短的多肽链。常用于断裂较短的多肽链。R R2 2=Phe,Trp,Tyr;Leu=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,MetIle,Met以及其它疏水性强的氨以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。基酸水解速度较快。R R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。2005-12-142005-12-14葡葡萄萄球球菌菌蛋蛋白白酶酶（Staphylococcal Staphylococcal protease)protease)当当裂裂解解在在磷磷酸酸缓缓冲冲液液(pH7.8)(pH7.8)中中进进行行的的，它它能能在在GluGlu残残基基和和AspAsp残残基基的的羧羧基基侧侧断断裂裂肽肽键键。如如果果改改用用碳碳酸酸氢氢铵铵缓缓冲冲液液(pH7.8)(pH7.8)或或醋醋酸酸铵铵缓缓冲液冲液(pH4.0)(pH4.0)时，则只能断裂时，则只能断裂GluGlu残基的羧基侧肽键。残基的羧基侧肽键。梭梭菌菌蛋蛋白白酶酶（clostripainclostripain）专专门门裂裂解解ArgArg残残基基的的羧羧基基所所形形成成的的肽肽键键。即即使使在在6mol/L6mol/L尿尿素素中中2020小小时时内内仍仍具具活活力力，这这样样对对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。2005-12-142005-12-14消化道内几种蛋白酶的专一性消化道内几种蛋白酶的专一性（）（）（）（）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe.Trp）2005-12-142005-12-142.2.化学裂解法化学裂解法 溴化氰溴化氰只断裂由只断裂由MetMet残基的羧基参加形成的肽键。残基的羧基参加形成的肽键。2005-12-142005-12-14羟羟胺胺能能专专一一性性地地断断裂裂Asn-GlyAsn-Gly之之间间的的肽肽键键。但但专专一一性性不不很强，如很强，如Asn-LeuAsn-Leu及及Asn-AlaAsn-Ala键也能部分裂解。键也能部分裂解。肽肽段段的的分分离离提提纯纯 多多肽肽链链用用上上述述方方法法断断裂裂后后，所所得得的的肽肽段段混混合合物物通通常常使使用用凝凝胶胶过过滤滤、凝凝胶胶电电泳泳、离离子子交交换换纤纤维维素素和和离离子子交交换换萄萄聚聚糖糖柱柱层层析析、高高效效液液相相色色谱谱、高高效效薄薄层层层层析析等等方方法法进进行分离提纯。行分离提纯。2005-12-142005-12-14化学降解化学降解（六）肽段氨基酸序列的测定（六）肽段氨基酸序列的测定2005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142.2.酶降解法酶降解法 蛋蛋 白白 水水 解解 酶酶 中中 有有 一一 类类 是是 肽肽 链链 外外 切切 酶酶 或或 称称 外外 肽肽 酶酶（exopeptidases)exopeptidases)，例例如如氨氨肽肽酶酶和和羧羧肽肽酶酶，它它们们分分别别从从肽肽链链的的N N端端和和C C端端逐逐个个地地向向里里切切。因因此此，原原则则上上只只要要能能跟跟随随酶酶水水解解的的过过程程分分别别定定量量测测出出释释放放的的氨氨基基酸酸，便便能能确确定定肽肽的的顺顺序序。然然而而这这种种方方法法实实际际上上有有许许多多困困难难，局局限限性性很很大大，它它只只能能用用来来测测定定末末端端附附近近很少几个残基的顺序。很少几个残基的顺序。二肽氨肽酶可从肽链的二肽氨肽酶可从肽链的N N端开始，每隔二个切断肽键，得到一系端开始，每隔二个切断肽键，得到一系列二肽片段，利用部分重迭法，拼凑出整条肽链的氨基酸顺序。列二肽片段，利用部分重迭法，拼凑出整条肽链的氨基酸顺序。ab cd ef gh ij kl mn op qr st uv wx yz ab cd ef gh ij kl mn op qr st uv wx yz a bc de fg hi jk lm no pq rs tu vw xy z a bc de fg hi jk lm no pq rs tu vw xy z abcdefghijklmnopqrstuvwxyz abcdefghijklmnopqrstuvwxyz2005-12-142005-12-144.4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法推定的依据是推定的依据是“中心法则中心法则”。推推定定法法仍仍需需与与直直接接的的氨氨基基酸酸序序列列分分析析相相配配合合，如如果果没没有有必必需需的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正确的密码读框。的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正确的密码读框。3.3.质谱法质谱法质质谱谱法法一一次次能能测测的的氨氨基基酸酸残残基基一一般般1010个个左左右右，但但质质谱谱法法具具有有样品用量少，分析速度快的优点。样品用量少，分析速度快的优点。2005-12-142005-12-14（七）肽段在多肽链中次序的决定（七）肽段在多肽链中次序的决定 示例示例示例示例(十肽的水解十肽的水解十肽的水解十肽的水解)A A法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：A A1 1 Ala-Phe Ala-Phe A A2 2 Gly-Lys-Asn-Tyr Gly-Lys-Asn-Tyr A A3 3 Arg-Tyr Arg-Tyr A A4 4 His-Val His-ValB B法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：B B1 1 Ala-Phe-Gly-Lys Ala-Phe-Gly-Lys B B2 2 Asn-Tyr-Arg Asn-Tyr-Arg B B3 3 Tyr-His-Val Tyr-His-Val重叠法：重叠法：Ala-Phe-Gly-LysAla-Phe-Gly-LysAsn-Tyr-ArgAsn-Tyr-ArgTyr-His-ValTyr-His-Val2005-12-142005-12-14（八）二硫桥位置的确定（八）二硫桥位置的确定一一般般采采用用胃胃蛋蛋白白酶酶处处理理含含有有二二硫硫键键的的多多肽肽链链(切切点点多多；酸酸性性环环境境下防止二硫键发生交换下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的对角线电泳技术进行分离。的对角线电泳技术进行分离。+-+-第第二二向向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解图中图中a a、b b两个斑点是由两个斑点是由一个二硫键断裂产生的一个二硫键断裂产生的肽段肽段2005-12-142005-12-14对角线电泳对角线电泳对对角角线线电电泳泳2005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142005-12-142005-12-14（九）蛋白质序列数据库（九）蛋白质序列数据库由由于于测测定定克克隆隆基基因因的的核核苷苷酸酸序序列列比比测测定定蛋蛋白白质质氨氨基基酸酸的的序序列列更更快快、更更有有效效，现现在在大大多多数数蛋蛋白白质质序序列列是是从从核核苷苷酸酸序序列列翻翻译译成成氨氨基基酸酸序序列列。要要确确定定一一个个新新序序列列，研研究究者者所所作作的的第第一一件件事事就就是是将将它它与与数数据据库库中中的的其其它它已已知知的的序序列列进进行行比比较较，确定其中是否存在同源性。确定其中是否存在同源性。2005-12-142005-12-14四、蛋白质的氨基酸序列四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能与生物功能（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化1.1.同源蛋白质同源蛋白质在在不不同同生生物物体体中中行行使使相相同同或或相相似似功功能能的的蛋蛋白白质质称称为为同同源源蛋蛋白白质质。同同源源蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列具具有有明明显显的的相相似似性性称称为为序序列列同同源源性性。2005-12-142005-12-14同同源源蛋蛋白白质质一一般般具具有有几几乎乎相相同同长长度度的的多多肽肽链链，它它们们的的氨氨基基酸酸序序列列与与那那些些提提取取它它们们的的物物种种的的亲亲缘缘关关系具有同一性。系具有同一性。10/27/2022不不不不同同同同生生生生物物物物来来来来源源源源的的的的细细细细胞胞胞胞色色色色素素素素c c c c中中中中不不不不变变变变的的的的AAAAAAAA残残残残基基基基1