目的基因的分离和克隆.ppt

第四章第四章目的基因目的基因的分离和克隆的分离和克隆第一节目的基因的获得第二节获得目的基因方法的选择第三节目的基因重组体的构建第一节目的基因的获得一、化学合成二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因三、建立基因组DNA文库四、构建cDNA文库筛选目的基因五、其他方法一、化学合成法化学合成法自动化DNA合成仪1.要要求求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列2）较短的DNA片段，有专一性和定向性2.原理原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3、5-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。应用范围：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探针3）人工接头及较小的基因二、建立基因组DNA文库基因组文库基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体。1.特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5端控制基因转录的调控序列,内含子的分布和作用,以及重复序列的数量分布及大小2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程）分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA制备全部基因组的DNA片断机械断裂法用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoR,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。DNA片断与载体的连接包装常用载体：粘性质粒噬菌体酵母人工染色体基因组DNA+粘性质粒重组DNA转化细菌菌落基因组DNA+噬菌体重组DNA包装成噬菌体感染细菌噬菌斑1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。基因组文库大小的计算1975年等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：In（1P）N=In（1f）P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99）；f为插入的限制片断长度整个基因组DNA总长度。例如：从人基因组DNA（总长度为3109bp）的文库中筛选到长约目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？In（1）N=9.2106In（11.51033109）若用质粒（pBR322）克隆目的基因（）需要有9106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5105左右,均可满足建库要求。载体种类装载量转染率噬菌体粘性质粒(Cosmid)酵母人工染色体(YAC)922kb3045kb1001000kb105106转化子gDNA104106转化子gDNA500转化子gDNA表表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较三种常用基因组文库克隆载体的比较四、构建cDNA文库cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）。特点：1.cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。2.mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。3.mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）4.可在原核细胞中表达有生物活性蛋白5.不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同6.不能研究基因组的结构功能构建cDNA文库1.1.制备制备mRNAmRNA1)取材：mRNA约占总RNA的15，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2)从总的RNA中分离mRNA将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸oligo(dT)纤维素中进行亲和层析2.2.第一股第一股 cDNA cDNA合成合成1）以Oligo(dT)为引物：从模板3末端开始，沿模板的35方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA2）随机引物：以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3.3.第二股第二股cDNAcDNA的合成的合成自身引导法：置换合成法外加引物合成法4.cDNA4.cDNA与载体连接和与载体连接和导入宿主细胞导入宿主细胞(如图4-5)筛选目的基因筛选目的基因核酸杂交法特殊标记的寡核苷酸链为探针将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）免疫结合法噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125I标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。获得目的基因的其他方法构建差示文库筛选特殊基因差示文库（differentiallibrary）又称扣除文库（subtractedlibrary）,是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。mRNA差异显示法获得目的基因mRNA差异显示（mRNAdifferentialdisplayDD）PCR法全称为DD-PCR法其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。基因改造可获得新型目的基因采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因间的相互作用（如协同抑制效应）。第二节获得目的基因方法的选择一、根据获得目的基因的研究目的选择方法为了研究基因全长结构、调控、DNA信息分析构建基因组文库，为了开展目的基因重组表达制药、治疗构建cDNA文库。若目的基因序列明确可设计引物通过PCR/RT-PCR克隆。若目的基因序列短小可化学合成。二、根据目的基因本身特点选择方法对从基因组中克隆的基因(内含子)只能真核表达对从cDNA中克隆的基因(无内含子)可在原核/真核表达要选择mRNA表达丰富的组织材料，PCR克隆的基因必须测序。三、根据实验室设备条件选择方法构建文库无需自行构建，有商品出售。目的基因序列明确，也无需建库，可直接用PCR/RT-PCR克隆。第三节目的基因重组体的构建一、质粒DNA的分离纯化二、目的基因与载体的连接二、目的基因与载体的连接粘性末端的连接粘性末端的连接1.单酶切点的粘性末端全同源性粘性末端高背景双向插入,不能定向（如前图2-5，2-6）2.双酶切片段的定向克隆粘粘非同源互补的粘性末端重组方案中最有效简捷的途径。粘平平端连接法平端连接法1.同聚物加尾法2.用衔接物连接法3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）EcoRI粘性末端：5AGCGGCCGCG3TCGCCGGCGCTTAA5BamHIPasI粘性末端：5GATCCGG.CACTGCA33GCC.GTG5BamHIPasI4.TA克隆法TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3端加上两个游离的“A”。目的基因目的基因：特定功能的基因与相应载体重组后能在宿主细胞中表达的DNA。相对宿主细胞称外源基因。化学合成法化学合成法用脱氧单核苷酸按特定的已知序列以3-5磷酸二酯键的形成（采用缩合反应），逐个进行延伸达所需长度后，去除保护剂，再分离纯化，即可获得目的基因。二、聚合酶链反应1.原理：以DNA变性复制的某些特性为原理，以目的DNA片段为模板,利用酶促反应（Taq酶），在特定引物的引导下，将加入的4种dNTP由引物沿模板从53按碱基配对原则,形成与模板DNA互补的半保留复制链,新合成的链又可作为下一轮循环的模板。经25-30个循环产物呈2n指数扩增，由pgg（紫外可见），可获得基因片段。（如图）目的DNA片段:染色体DNART-PCR：cDNA2.应用：1）诊断带有异常外源基因（如病毒）变异基因（肿瘤、遗传病等）2）合成特异基因或目的基因3）合成特异探针3.特点：反复循环便于获得大量的基因拷贝Taq酶作用下每一轮PCR循环会产生103104的错配率,所以多用于基因检测，如果用于基因重组表达，在此之前必须进行DNA序列分析。原核生物原核生物：基因组小，限制性核酸内切酶切成若干片段后，用带有标记的核酸探针进行杂交筛选，人或哺乳类动物细胞：人或哺乳类动物细胞：基因组庞大，采用DNA重组技术把某种生物细胞的所有基因分区组装到载体（质粒或噬菌体）上，并随载体导入宿主细胞中进行克隆培养和保存这种克隆群体，这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞（大肠杆菌）中的各种重组DNA分子的集合体叫做DNA文库,简称文库（Library）。