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微生物蛋白酶的分子和生微生物蛋白酶的分子和生物技术方面的概述物技术方面的概述Molecular and Biotechnological Aspects ofMicrobial Proteases 汇报人：马纳纳 2012年9月20日PROTEASES1.来源2.分类3.应用1.动力学机制2.生理学功能1.基 因 改 造2.蛋白质工程3.序列同源性及进化关系 一一.蛋白酶的来源蛋白酶来源广，数量多，用途广。蛋白酶是重要工业酶之一，约占世界范围酶总量的60%。根据蛋白酶来源，可将其分为植物蛋白酶（Plant Proteases），动物蛋白酶（Animal Proteases），微生物蛋白酶（Microbial Proteases）。Plant Proteases木瓜蛋白酶Papain(最适pH59)菠萝蛋白酶Bromelain(最适pH59）角蛋白酶Keratinases（降解毛发等）Animal Proteases胰蛋白酶 Trypsin（丝氨酸蛋白酶，水解lys，arg羧基形成的肽键）胃蛋白酶 Pepsin（最适 pH12，水解位点在两个疏水 氨基酸之间）凝乳酶 Rennin(类似胃蛋白酶，特异 切割k-酪蛋白的单一肽键）糜蛋白酶 Chymotrypsin（水解 phe，try，tyr 羧基形成的肽键）Microbial Proteases细菌蛋白酶真菌蛋白酶病毒蛋白酶细菌蛋白酶主要为芽孢杆菌属产生的酸性和碱性蛋白酶。中性蛋白酶最适pH58，耐热性相对较低。一些中性蛋白酶是金属蛋白酶，其活性需金属二价离子；而一些是丝氨酸蛋白酶，不受螯合物影响。碱性蛋白酶最适pH为碱性，有很宽的底物特异性。广泛用于洗涤工业。真菌蛋白酶真菌产蛋白酶多于细菌。eg：Aspergillus oryzae（米曲霉）产生酸性，中性，碱性蛋白酶。但是真菌蛋白酶的反应速率和耐热性都低于细菌。酸性蛋白酶最佳，用于奶酪制作行业。中性蛋白酶是金属蛋白酶，在pH为7时有活性，可被螯合物抑制。用于食品行业中蛋白脱苦。碱性蛋白酶也用于食品中蛋白的改造。病毒蛋白酶已经发现多种病毒中含ser，asp，cys蛋白酶。主要用于病毒自身蛋白的加工。所有病毒编码的都是内肽酶，无金属蛋白酶。研究最多的是逆转录病毒的天冬氨酰蛋白酶。它是病毒组装和复制必须的，是病毒多聚蛋白前体的一部分。前体经过自我催化成为成熟的蛋白酶。二.蛋白酶的分类1.按作用部位分为2.按活性部位的 功能基分为 外肽酶内肽酶 外肽酶外肽酶分Aminopeptidase和carboxypeptidase。氨肽酶多为胞内酶，广泛存在于细菌和真菌中。它从多肽链N端水解下一个氨基酸残基，二肽或是三肽。羧肽酶作用于多肽链的C端，水解下一个氨基酸或是二肽。据酶活性位点氨基酸残基的特点，可将羧肽酶分为:丝氨酸羧肽酶，金属羧肽酶，半胱氨酸羧肽酶。内肽酶 据催化机制可分为ser蛋白酶，asp蛋白酶，cys蛋白酶和金属蛋白酶。1.Ser蛋白酶：其四个家族（糜蛋白酶简写SA，枯草杆菌蛋白酶简写SB，羧肽酶C简写SC,大肠杆菌D-Ala D-Ala 肽酶A简写SE）基本结构完全不相关，表明ser蛋白酶至少有四个独立的进化来源。Ser蛋白酶第一大亚类是ser碱性蛋白酶，底物特异性与糜蛋白酶类似但没它严格。第二大亚类是枯草杆菌蛋白酶，已发现两种，有共同活性位点ser221，his64，asp32。2.Asp蛋白酶：是一类催化活性依赖asp的内肽酶。多数在低pH时表现最大活性。活性位点Asp-Ser/Thr-Gly。被胃酶抑素抑制。3.Cys/巯基蛋白酶：催化活性包括Cys和His催化二分体。通常只在有还原基团（HCN 或Cys）存在下才有活性。中性至碱性pH。对巯基化合物敏感，但不受DFP和金属螯合物影响.4.金属蛋白酶：活性依赖二价金属离子。活性易被螯合物比如EDTA抑制，但不受巯基化合物或DFP的影响。研究最多的是嗜热菌蛋白酶和胶原酶。三三.蛋白酶的应用蛋白酶的应用n nProteases have a large variety of applications,mainly in Proteases have a large variety of applications,mainly in the detergent and food industries.In view of the recent the detergent and food industries.In view of the recent trend of developing environmentally friendly trend of developing environmentally friendly technologies,proteases are envisaged to have extensive technologies,proteases are envisaged to have extensive applications in leather treatment and in several applications in leather treatment and in several bioremediation processes.bioremediation processes.n n例如：用于洗涤剂的碱性蛋白酶应有例如：用于洗涤剂的碱性蛋白酶应有1 1）广泛的底）广泛的底物特异性，以加速多种污迹的去除。物特异性，以加速多种污迹的去除。2 2）在洗涤剂）在洗涤剂各种助剂如螯合剂、氧化剂等共存下稳定。各种助剂如螯合剂、氧化剂等共存下稳定。n n纳豆激酶：溶栓作用。纳豆激酶：溶栓作用。四四.蛋白酶动力学机制蛋白酶动力学机制n n研究蛋白酶动力学，必先纯化，纯化方法有亲和研究蛋白酶动力学，必先纯化，纯化方法有亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤层析等。层析，离子交换层析，凝胶过滤层析等。n n1.1.丝氨酸蛋白酶：据其底物偏好可分为：类胰蛋白丝氨酸蛋白酶：据其底物偏好可分为：类胰蛋白酶，类糜蛋白酶和类弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶酶，类糜蛋白酶和类弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶含有含有Ser-His-AspSer-His-Asp催化三联体。催化三联体。It involves a two-step reaction for hydrolysis.This acylation step is This acylation step is followed by a deacylation process which occurs by a followed by a deacylation process which occurs by a nucleophilic attack on the interme-diate by water,nucleophilic attack on the interme-diate by water,resulting in hydrolysis of the peptide.resulting in hydrolysis of the peptide.n n2.2.天冬氨酸蛋白酶：通过晶体结构分析可得出催化天冬氨酸蛋白酶：通过晶体结构分析可得出催化特异性。酸碱催化分析得出活性位点有特异性。酸碱催化分析得出活性位点有Asp-Thr-Asp-Thr-GlyGly基团。基团。n n3.3.金属蛋白酶：金属蛋白酶：X X射线晶体结构分析得出，其活性依射线晶体结构分析得出，其活性依赖于一个二价金属离子（通常是锌离子）结合到赖于一个二价金属离子（通常是锌离子）结合到His-His-Glu-Xaa-Xaa-HisGlu-Xaa-Xaa-His基团。金属蛋白酶活性可因透析或加基团。金属蛋白酶活性可因透析或加入螯合物而失掉。入螯合物而失掉。n n4.4.半胱氨酸蛋白酶：植物中木瓜蛋白酶被认为是半胱半胱氨酸蛋白酶：植物中木瓜蛋白酶被认为是半胱氨酸蛋白酶的原始类型和这类酶的很好例子。它们催氨酸蛋白酶的原始类型和这类酶的很好例子。它们催化肽，巯基酯和硫羰基酯键的水解。水解机制与丝氨化肽，巯基酯和硫羰基酯键的水解。水解机制与丝氨酸蛋白酶非常相似。酸蛋白酶非常相似。五.蛋白酶的生理学功能 In general,extracellular proteases catalyze In general,extracellular proteases catalyze the hydrolysis of large proteins to smaller the hydrolysis of large proteins to smaller molecules for sub-sequent absorption by molecules for sub-sequent absorption by the cell whereas intracellular proteasesthe cell whereas intracellular proteases play a critical role in the regulation of play a critical role in the regulation of metabolism.metabolism.n n1.1.蛋白更新：例如大肠杆菌中，蛋白更新：例如大肠杆菌中，ATPATP依赖性蛋白依赖性蛋白酶负责非正常蛋白的水解。真核生物胞内蛋白酶酶负责非正常蛋白的水解。真核生物胞内蛋白酶的更新也受到的更新也受到ATPATP依赖性蛋白酶的影响。依赖性蛋白酶的影响。n n2.2.芽孢和孢子释放：用蛋白酶抑制剂证实芽孢形成需芽孢和孢子释放：用蛋白酶抑制剂证实芽孢形成需要蛋白酶。提高蛋白酶要蛋白酶。提高蛋白酶A A的活性与酵母二倍体子囊孢的活性与酵母二倍体子囊孢子的形成有关。子的形成有关。n n3.3.休眠孢子的萌发：休眠孢子中，丝氨酸内肽酶降解休眠孢子的萌发：休眠孢子中，丝氨酸内肽酶降解蛋白质生成的氨基酸和氮为新蛋白质和核苷酸类的生蛋白质生成的氨基酸和氮为新蛋白质和核苷酸类的生物合成提供原料。物合成提供原料。n n4.4.酶的修饰：许多蛋白酶是以酶原的形式存在。酶的修饰：许多蛋白酶是以酶原的形式存在。Kex-2 Kex-2蛋白酶是真核酶前体加工处理的典型。通过特蛋白酶是真核酶前体加工处理的典型。通过特异性裂解羧基末端残基对，催化激素原和分泌途径的异性裂解羧基末端残基对，催化激素原和分泌途径的完整膜蛋白的水解。完整膜蛋白的水解。肠激酶肠激酶 胰蛋白酶原胰蛋白酶原 胰蛋白酶胰蛋白酶 胰蛋白酶胰蛋白酶n n胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 疏水氨基酸存在下疏水氨基酸存在下n n胃蛋白酶原胃蛋白酶原自我催化为胃蛋白自我催化为胃蛋白酶酶 胃蛋白酶激活或自我催化胃蛋白酶激活或自我催化n n凝乳酶原凝乳酶原凝乳酶凝乳酶n n5.5.细胞营养：蛋白酶水解较大肽链为小肽和氨基酸，细胞营养：蛋白酶水解较大肽链为小肽和氨基酸，有助于被细胞吸收。胞外酶由于脱聚合化活性在细有助于被细胞吸收。胞外酶由于脱聚合化活性在细胞营养中占重要作用。胞营养中占重要作用。n n6.6.基因表达调控：基因表达调控：ATPATP依赖性蛋白酶有新的生理学依赖性蛋白酶有新的生理学功能，可作为蛋白分子伴侣，介导蛋白水解，蛋白功能，可作为蛋白分子伴侣，介导蛋白水解，蛋白络合物的分解和聚合化。此外，蛋白酶还介导许多络合物的分解和聚合化。此外，蛋白酶还介导许多调节蛋白的分解。调节蛋白的分解。六六.微生物蛋白酶的基因改造微生物蛋白酶的基因改造n n基因工程基因工程基因工程微生物基因工程微生物目的：提高产量，目的：提高产量，阐明结构，蛋白工程。阐明结构，蛋白工程。n n1.细菌n n1 1）芽孢杆菌属：一些芽孢杆菌属分泌两种主要的）芽孢杆菌属：一些芽孢杆菌属分泌两种主要的工业用蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶（碱性蛋白酶）工业用蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶（碱性蛋白酶）和金属蛋白酶（中性蛋白酶）。和金属蛋白酶（中性蛋白酶）。n n枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属蛋白酶基因克隆的宿枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属蛋白酶基因克隆的宿主。主。n n2 2）乳链球菌属：其蛋白酶基因主要在质粒上，分为）乳链球菌属：其蛋白酶基因主要在质粒上，分为PIPI型蛋白酶和型蛋白酶和PIIIPIII型蛋白酶。型蛋白酶。n n3 3）链霉菌属：分泌两种胞外蛋白酶）链霉菌属：分泌两种胞外蛋白酶A A和和B B。DNADNA序列序列分析表明，这两种蛋白酶都是先产生酶前体，然后再分析表明，这两种蛋白酶都是先产生酶前体，然后再切去切去NN末端前肽。两种蛋白酶编码区域的高度同源性末端前肽。两种蛋白酶编码区域的高度同源性表明表明sprAsprA和和sprBsprB肯定来源于基因复制。肯定来源于基因复制。n n4 4）假单胞菌属）假单胞菌属：P.aeruginosaP.aeruginosa分泌两种蛋白酶，一种分泌两种蛋白酶，一种碱性蛋白酶和弹性蛋白酶。菌株碱性蛋白酶和弹性蛋白酶。菌株PAO1PAO1的编码碱性蛋白的编码碱性蛋白酶基因片段在启动子酶基因片段在启动子tactac控制下可在大肠杆菌中表达。控制下可在大肠杆菌中表达。n n5 5）大肠杆菌：）大肠杆菌：11膜蛋白酶：跨膜蛋白酶以一个大的前膜蛋白酶：跨膜蛋白酶以一个大的前体形式存在，它的氨基末端有信号肽。前体的加工包括体形式存在，它的氨基末端有信号肽。前体的加工包括两个连续的过程，一是通过内切将信号肽去掉。二是消两个连续的过程，一是通过内切将信号肽去掉。二是消化切去的信号肽。化切去的信号肽。2ATP2ATP依赖的蛋白酶依赖的蛋白酶:大肠杆菌中有大肠杆菌中有三个家族，细胞提取物的体外分析表明主要的三个家族，细胞提取物的体外分析表明主要的ATPATP依赖依赖活性是活性是lonlon蛋白酶。蛋白酶。n n6 6）蛋白酶的）蛋白酶的IgAIgA家族：核酸序列分析表明酶以大的前体家族：核酸序列分析表明酶以大的前体形式存在，它有三个结构域，即形式存在，它有三个结构域，即NN末端前肽，蛋白酶，末端前肽，蛋白酶，和和C C末端末端”协助协助“肽。这些酶前体的前肽部分（信号肽）肽。这些酶前体的前肽部分（信号肽）作用是帮助酶的跨膜转运。作用是帮助酶的跨膜转运。n n2.真菌：n n丝状真菌丝状真菌 1 1）酸性蛋白酶：毛霉属和根霉属大量分）酸性蛋白酶：毛霉属和根霉属大量分泌泌aspasp蛋白酶。蛋白酶。2 2）碱性蛋白酶）碱性蛋白酶：曲霉菌属，支顶胞：曲霉菌属，支顶胞属，镰刀菌属属，镰刀菌属 分泌碱性蛋白酶。分泌碱性蛋白酶。3 3）丝氨酸蛋白酶：）丝氨酸蛋白酶：蛋白酶蛋白酶K K是真菌分泌的丝氨酸外肽酶。是真菌分泌的丝氨酸外肽酶。4 4）金属蛋白）金属蛋白酶：酶：n n酵母：酵母：1 1）酸性蛋白酶：酿酒酵母的）酸性蛋白酶：酿酒酵母的PEP4PEP4基因编码基因编码一种一种aspasp蛋白酶，是一种翻译后调控的酵母液泡水解蛋白酶，是一种翻译后调控的酵母液泡水解酶。酶。2 2）碱性蛋白酶）碱性蛋白酶33）丝氨酸蛋白酶）丝氨酸蛋白酶n n3.病毒：研究最多的是逆转录病毒。基因有长末端：研究最多的是逆转录病毒。基因有长末端重复序列。重复序列。小结小结 研究目的研究目的 采用相应的策略采用相应的策略1.1.有效提高蛋有效提高蛋白酶表达量白酶表达量 更换相应蛋白酶的强启动子。更换相应蛋白酶的强启动子。2.2.研究某一基研究某一基因的表达调控因的表达调控克隆具高度同源性的基因，用基克隆具高度同源性的基因，用基因敲除和基因突变技术。因敲除和基因突变技术。3.3.某一基因的某一基因的同源性分析同源性分析 克隆和测定克隆和测定DNADNA序列，同源性分序列，同源性分析可找到共同祖先。析可找到共同祖先。4.4.某一基因的某一基因的定位和定向定位和定向 可通过基因敲除分析技术确定。可通过基因敲除分析技术确定。七.蛋白质工程快速发展归功于重组DNA技术和定点突变技术。两大主要任务:基因鉴定和蛋白三维结构分析。细菌中以枯草杆菌蛋白酶为例，二硫键的引入增强了其热稳定性。真菌中以天冬氨酸蛋白酶为例，用定点突变技术对其活性部位asp76突变为ser，确定此此酶的底物结合位点特异性。八.蛋白酶的序列同源性及进化关系测定蛋白酶核苷酸和氨基酸序列测定蛋白酶核苷酸和氨基酸序列对比对比 阐明结阐明结构和功能关系。构和功能关系。例如在四种中性蛋白酶中，例如在四种中性蛋白酶中，1717个残基的氨基酸序个残基的氨基酸序列（包括活性位点列（包括活性位点hishis）高度保守，表明其活性位）高度保守，表明其活性位点有共同的三维结构。点有共同的三维结构。同源性与许多因素有关，如结构，功能，来源，同源性与许多因素有关，如结构，功能，来源，活性部位等。活性部位等。序列同源性越高，表明进化关系越近。序列同源性越高，表明进化关系越近。九.现存问题和解决方案1.1.增强热稳定性：位点特异性突变技术引入增强热稳定性：位点特异性突变技术引入二硫键；用疏水氨基酸替换极性氨基酸。二硫键；用疏水氨基酸替换极性氨基酸。2.2.防止蛋白自我水解：使自溶位点氨基酸产防止蛋白自我水解：使自溶位点氨基酸产生突变。生突变。3.3.改变最佳改变最佳pHpH：改变蛋白表面的总电荷量。：改变蛋白表面的总电荷量。4.4.改变底物特异性：用位点特异性突变或重改变底物特异性：用位点特异性突变或重组随机突变技术。组随机突变技术。5.5.提高酶产量：用传统突变或重组提高酶产量：用传统突变或重组DNADNA技技术筛选高产菌株；优化培养条件。术筛选高产菌株；优化培养条件。十.蛋白酶未来发展前景1.重组DNA快速测序技术使人们了解到更多的蛋白酶序列信息。2.更多的嗜极微生物蛋白酶得到关注。3.更多关注聚集在蛋白酶对癌症，疟疾，AIDS等人类致命疾病的治疗方面。Thank you！