《微生物学实验》PPT课件.ppt

医学微生物学实验室规则医学微生物学实验室规则一.进入实验室必须穿白大衣,不必需的物品不要 携带入室。二.保持实验室的安静和秩序,实验要严肃认真。三.如有传染性材料的污染,及时报告老师。四.实验过程中有仪器和器材的损坏要报告老师 并登记。五.实验后的材料要放到指定的位置。六.离开实验室前,要用肥皂洗手,接触过传染性强 的实验材料要用0.1%的新洁尔灭泡手1-2分钟七.值日生要作好值日工作,关好水,电,门窗,作好 实验记录本的登记方可离开实验室。目的要求目的要求:1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备2、了解空气、皮肤细菌检查方法、了解空气、皮肤细菌检查方法3、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法实验一实验一药品的微生物限度检查（一）药品的微生物限度检查（一）实验室常用消毒灭菌设备实验室常用消毒灭菌设备空气和皮肤细菌检查方法空气和皮肤细菌检查方法一一.药品的微生物限度检查（一）药品的微生物限度检查（一）1.口服药物的微生物检查口服药物的微生物检查:大肠杆菌的检查：大肠杆菌的检查：细菌总数的检查细菌总数的检查2.外用药物的微生物检查外用药物的微生物检查:绿脓杆菌的检查：绿脓杆菌的检查：金黄色葡萄球菌的检查：金黄色葡萄球菌的检查：口服药口服药外用药外用药药品的微生物限度检查实验方法药品的微生物限度检查实验方法（一）（一）1.药品的预处理药品的预处理2克药品加克药品加20毫升生理盐水，毫升生理盐水，研磨制成悬液研磨制成悬液 2.细菌培养细菌培养外服药外服药口口用药用药药品混悬液药品混悬液10毫升加入毫升加入胆盐乳糖胆盐乳糖增菌液中增菌液中药品混悬液药品混悬液10毫升加入毫升加入胆盐乳糖胆盐乳糖增菌液中增菌液中药品混悬液药品混悬液10毫升加入毫升加入亚碲酸钠亚碲酸钠增菌液中增菌液中37,24小时小时37,24小时小时 将剩余将剩余口服药口服药以以10-1 10-2 10-3 10-4 进行稀释进行稀释(以生以生理盐水稀释理盐水稀释)3.细菌总数测定细菌总数测定加加溶化的琼脂培养基溶化的琼脂培养基中，混匀，冷却后中，混匀，冷却后,置置37恒温培养箱培养恒温培养箱培养24小时小时。取三个中试管取三个中试管各管加各管加9ml生理盐水生理盐水从剩余从剩余10ml悬液中悬液中取取1ml加入第一个稀释管中加入第一个稀释管中1ml10-110-410-210-39ml生理盐水生理盐水从上述三个稀释管中各取从上述三个稀释管中各取1ml1ml10-110-410-210-3二二.空气、皮肤细菌检查方法空气、皮肤细菌检查方法(验证验证)三三.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅消毒煮沸器消毒煮沸器G6玻璃滤菌器装置玻璃滤菌器装置洁净工作台洁净工作台移动式移动式紫外光灯紫外光灯鼓风式干烤箱鼓风式干烤箱紫外线杀菌标本。紫外线杀菌标本。厌氧工作站厌氧工作站催化剂（钯粒）催化剂（钯粒）厌氧培养罐厌氧培养罐电热恒温培养箱电热恒温培养箱二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱一、目的要求一、目的要求:1、了解细菌培养接种技术、了解细菌培养接种技术2、掌握细菌基本形态、掌握细菌基本形态3、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容1.药物的微生物限度检查（二）药物的微生物限度检查（二）2.空气、皮肤细菌检查结果测定。空气、皮肤细菌检查结果测定。3.讲授基础培养基的制备方法讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。（营养琼脂、营养肉汤）。4.培养基的种类和用途培养基的种类和用途普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基5.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能基本技能)液体培养基液体培养基平板培养基平板培养基斜面培养基斜面培养基双糖含铁半固体斜面培养基双糖含铁半固体斜面培养基6.显微镜下观察显微镜下观察细菌的基本形态细菌的基本形态:球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。特殊结构：特殊结构：肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。实验二实验二药品的微生物限度检查（二）药品的微生物限度检查（二）细菌的形态学检查及培养接种技术细菌的形态学检查及培养接种技术 取出前次实验培养物观察：取出前次实验培养物观察：1.1.口服药物口服药物1)1)细菌鉴定：细菌鉴定：在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长：在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长：增菌液变混浊增菌液变混浊有有 -接种在接种在伊红美兰伊红美兰琼脂平板培养基琼脂平板培养基 上面。上面。方法：分区划线接种。方法：分区划线接种。2)2)细菌总数测定：细菌总数测定：选择选择30-30030-300个菌落平板，个菌落平板，细菌总数菌落数细菌总数菌落数稀释倍数稀释倍数药物的微生物限度检查方法（二）2.2.外用药外用药1)1)判定判定胆盐乳糖增菌液培养物胆盐乳糖增菌液培养物及及亚碲酸钠增菌液培亚碲酸钠增菌液培养物养物有无细菌生长：有无细菌生长：增菌液变混浊增菌液变混浊有有2)2)细菌鉴定：细菌鉴定：（1 1）将）将胆盐乳糖增菌液培养物胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在无菌接种在1616烷三甲烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基基溴化胺琼脂斜面培养基上面。上面。方法：斜面化线接种；方法：斜面化线接种；（2 2）将）将亚碲酸钠增菌液培养物亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在，无菌接种在卵黄高卵黄高盐琼脂平板培养基盐琼脂平板培养基上面。上面。方法：分区划线接种。方法：分区划线接种。37 37恒温孵育箱恒温孵育箱2424小时培养后，观察结果。小时培养后，观察结果。分区划线法菌落斜面移种技术菌苔液体移种技术穿刺技术穿刺技术细菌基本形态细菌基本形态球菌球菌杆菌杆菌螺形菌螺形菌葡萄球菌葡萄球菌链球菌链球菌大肠埃希菌枯草杆菌霍乱弧菌细菌特殊结构细菌特殊结构鞭毛荚膜芽孢破伤风梭菌spore一、目的要求一、目的要求:1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察2、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容1.药物的微生物限度检查（三）药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察细菌的生长现象及代谢产物的观察1）液体培养基）液体培养基-沉淀、浑浊、表面生长现象。沉淀、浑浊、表面生长现象。2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。3）双糖含铁培养基）双糖含铁培养基-动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。4）结核杆菌菌落的观察。）结核杆菌菌落的观察。3.中草药、抗生素抑菌试验中草药、抗生素抑菌试验1）中草药）中草药-大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。2）抗生素）抗生素-青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。实验三实验三药品的微生物限度检查（三）微生物的形态学检查及药物的敏感性试验 1）从）从伊红美兰伊红美兰琼脂平板培养基上琼脂平板培养基上-挑取挑取黑色带有金属光泽黑色带有金属光泽的的湿润湿润菌落，接种在菌落，接种在普通琼脂斜普通琼脂斜面面培养基上面，进行细菌的培养基上面，进行细菌的纯培养纯培养。2）观察）观察外用药物外用药物在在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长培养基上生长状况。状况。记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。度等。革兰氏染色镜下革兰氏染色镜下观察其菌落形态。观察其菌落形态。根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的名称。被检菌的名称。3）从）从卵黄高盐卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润黄色的湿润菌落，菌落，接种在接种在普通琼脂斜面普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的培养基上面，进行细菌的纯培养纯培养。药物的微生物限度检查（三）药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察细菌的生长现象及代谢产物的观察混浊生长混浊生长菌膜菌沉淀均匀浑浊对照菌膜生长菌膜生长革兰染色步骤革兰染色步骤1.制片：制片：取标本取标本（球杆混合物、牙垢）球杆混合物、牙垢）涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定2.初染初染：结晶紫：结晶紫1min水洗水洗3.媒染：媒染：碘液碘液1min水洗水洗4.脱色：脱色：95%酒精酒精30s水洗水洗5.复染：复染：沙黄沙黄1min水洗、滤纸吸干水洗、滤纸吸干6.油镜观察油镜观察：1、制片、制片涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定2.结晶紫初染结晶紫初染1min水洗水洗3.碘液媒染碘液媒染1min水洗水洗4.95%酒精脱色酒精脱色30s水洗水洗5.沙黄复染沙黄复染1min水洗、滤纸吸干水洗、滤纸吸干6.油镜观察油镜观察结果革兰阳性菌：紫色革兰阳性菌：紫色革兰阴性菌：红色革兰阴性菌：红色3.中草药、抗生素抑菌试验中草药、抗生素抑菌试验 纸片法实验四实验四药物的微生物限度检查（四）药物的微生物限度检查（四）病毒和细菌及其他病原微生物病毒和细菌及其他病原微生物一、目的要求一、目的要求1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态2、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容1、药物的药物的微生物限度检查（四）、药物的药物的微生物限度检查（四）1）将）将口服药物口服药物中的细菌分别接种：中的细菌分别接种：蛋白胨水培养基；蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。同时接种同时接种产气杆菌产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。试验。2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物外用药物中细菌进行中细菌进行血浆凝固酶血浆凝固酶检测检测,依依据据其反应结果其反应结果,确定该菌的性质及名称。确定该菌的性质及名称。2、抗酸染色、抗酸染色3、真菌培养物的观察、真菌培养物的观察-黑曲霉、木霉黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，酵母菌菌落的观察。酵母菌菌落的观察。4、记录中草药、抗生素抑菌试验结果、记录中草药、抗生素抑菌试验结果5、流感病毒的血球凝集试验、流感病毒的血球凝集试验6、观察鸡胚的结构、观察鸡胚的结构7、抗、抗“O”试验试验生化反应管生化反应管待检细菌待检细菌对照菌对照菌(产气杆菌产气杆菌)蛋白胨水培养蛋白胨水培养基基2支管支管接种接种1支管支管接种接种1支管支管葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培养基水培养基4支管支管接种接种2支管支管接种接种2支管支管枸橼酸盐培养枸橼酸盐培养基基2支管支管接种接种1支管支管接种接种1支管支管接种细菌的对应生化反应管接种细菌的对应生化反应管i.制片（涂片、干燥、固定）；制片（涂片、干燥、固定）；ii.石炭酸复红初染石炭酸复红初染（加热、加热、盖滤纸片）5min-水洗；水洗；iii.3盐酸酒精脱色盐酸酒精脱色（15S,水洗）；水洗）；iv.美兰复染（美兰复染（1min，水洗）-滤纸吸干滤纸吸干v.镜检。镜检。抗酸染色步骤抗酸染色步骤结核杆菌抗生素体外抑菌试验（二）记录纸片法结果记录纸片法结果测量抑菌环直径测量抑菌环直径 病毒的分离培养鸡胚接种 动物接种动物接种 鸡胚培养鸡胚培养 组织细胞培养组织细胞培养病毒的培养方法：病毒的培养方法：病毒的分离培养鸡胚接种病毒名称病毒名称接种部位接种部位鸡鸡胚胚胚胚龄龄（天）（天）痘痘类类病毒病毒绒绒毛尿囊膜毛尿囊膜10101313流感、副流感、腮腺流感、副流感、腮腺炎病毒炎病毒尿囊尿囊9 9 1111嗜神嗜神经经病毒病毒卵黄囊卵黄囊5 58 8初次分离初次分离标标本本羊膜腔羊膜腔10101212病毒的分离培养鸡胚培养菌 丝大分生孢子小分生孢子白念珠菌 新型隐球菌青霉烟曲霉黄曲霉曲霉实验五实验五药物的微生物限度检查（五）药物的微生物限度检查（五）一、目的要求一、目的要求掌握药品的微生物学检验程序和方法掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容以生化反应（以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。）检测口服药中细菌的性质。-试验试验培养基培养基加试剂加试剂试验结果试验结果大肠埃希菌大肠埃希菌产气杆菌产气杆菌吲哚吲哚(I)蛋白胨水蛋白胨水2管管苯甲醛试剂苯甲醛试剂0.5ml(5滴滴)红红阳性（阳性（+）无色变无色变阴性（阴性（-）甲基红甲基红(M)葡萄糖蛋白葡萄糖蛋白胨水胨水2管管甲基红甲基红5滴滴红色红色阳性（阳性（+）黄色黄色阴性（阴性（-）VP葡萄糖蛋白葡萄糖蛋白胨水胨水2管管培氏乙培氏乙6滴滴萘酚试剂萘酚试剂6滴滴无色变无色变阴性（阴性（-）红色红色阳性（阳性（+）枸椽酸盐枸椽酸盐(C)枸橼酸盐枸橼酸盐2管管绿无色变绿无色变阴性（阴性（-）绿绿蓝色蓝色阳性（阳性（+）吲哚试验吲哚试验左：产气肠杆菌（左：产气肠杆菌（），右：大肠埃希菌（），右：大肠埃希菌（+）甲基红试验：甲基红试验：左：产气肠杆菌（左：产气肠杆菌（）；右：大肠埃希菌（）；右：大肠埃希菌（+）VP试验试验 左：大肠埃希菌（左：大肠埃希菌（）；右：产气肠杆菌（）；右：产气肠杆菌（+）