《药物分析》抗生素类药物的分析.ppt

第十一章第十一章 抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析一、概述一、概述1.抗生素（抗生素（antibiotics）：）：在低微浓度下即可对某些生物在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）病原微生物）的生命活动有特异的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称抑制作用的化学物质的总称内酰胺类内酰胺类氨基糖苷类氨基糖苷类四环素类四环素类大环内酯类大环内酯类多烯大环类多烯大环类多肽类多肽类3.来源：来源：生物合成（发酵）生物合成（发酵）化学合成或半合成化学合成或半合成4.抗生素的特点：抗生素的特点：化学纯度较低化学纯度较低 活性组分易发生变异活性组分易发生变异 稳定性差稳定性差生产工艺复杂生产工艺复杂发酵过程不易控发酵过程不易控制易受污染制易受污染采用采用生物学法生物学法与与物理化学法物理化学法鉴别：鉴别：理化方法理化方法、微生物法微生物法检查：检查：水分、水分、pH值、异常毒性、热原、细菌值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等内毒素、降压物质等含量含量/效价测定：效价测定：微生物法微生物法：与临床疗效吻合与临床疗效吻合,灵敏度高；但灵敏度高；但操作复杂费时操作复杂费时 理化方法：理化方法：准确度与专属性较高准确度与专属性较高,且操作简且操作简便；但与临床疗效有偏差便；但与临床疗效有偏差二、二、内酰胺类内酰胺类包括青霉素类和头孢菌素类包括青霉素类和头孢菌素类1.化学结构：化学结构：青霉素类：青霉素类：6-APA为母核为母核头孢菌素类：头孢菌素类：7-ACA为母核为母核*2.主要理化性质：主要理化性质：1）酸性（羧基）：）酸性（羧基）：pKa 2.5-2.8 酸性较强酸性较强 与碱金属成盐后水溶性好与碱金属成盐后水溶性好2）UV（共轭）：（共轭）：青霉素类：苯环取代基青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构头孢菌素类：母核有共轭结构3）旋光性：）旋光性：有多个手性碳有多个手性碳4）稳定性（内酰胺）：）稳定性（内酰胺）：干燥条件较稳定，溶液不稳定干燥条件较稳定，溶液不稳定 青霉素青霉素 降解、失效降解、失效氧化剂、酸、碱氧化剂、酸、碱酶、金属离子、酶、金属离子、3.鉴别鉴别1）羟肟酸铁反应：）羟肟酸铁反应：内酰胺类内酰胺类 羟肟酸羟肟酸 显色显色2）茚三酮反应）茚三酮反应-氨基氨基 蓝紫色蓝紫色3）双缩脲反应）双缩脲反应内酰胺类内酰胺类 紫色紫色4）光谱法（光谱法（UV、NMR）5）色谱法（）色谱法（HPLC、TLC）NH2OHHClNaOHFe3+H+茚三酮茚三酮 碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜呈呈色色反反应应头孢利定的头孢利定的NMR鉴别法鉴别法(JP14)取本品50mgml重水中，测定NMR光谱时，应显示3.8 附近 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2 ：3 ：5强度比强度比头孢氨苄鉴别的TLC条件ChP(2000)5mg/ml 2l 硅胶G mol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)；0.1%茚三酮溶液显色USP(24)25mg/ml 5l 硅胶 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)；短波长UV光检出BP(1999)0.4%(W/V)1l 硅烷化硅胶HF254 15.4%NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)；254nm检出聚合物、有关物质、异构体等聚合物、有关物质、异构体等头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定色色谱谱条条件件与与系系统统适适用用性性试试验验 用葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶G-10（40120m）为填充剂，玻玻璃璃柱柱1.5cm，床体积5060ml；流流动动相相Amol/L磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液gg，加水1000ml使溶解，调节pH至7.0），流流动动相相B为为0.01%十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠溶溶液液；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm。以流流动动相相A为为流流动动相相，用用1mg/ml蓝蓝色色葡葡聚聚糖糖2000溶溶液液进进样样200 l，对对照照品品溶溶液液以以流流动动相相B为为流流动动相相，重重复复进进样样200 l，峰面积值的相对标准差应小于峰面积值的相对标准差应小于5.0%对对照照品品溶溶液液的的制制备备：取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀测测定定法法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以以流流动动相相A为为流流动动相相进进行行测测定定，记记录录色色谱谱图图；另取取对对照照品品溶溶液液200 l注注入入液液相相色色谱谱仪仪，以以流流动动相相B为为流流动动相相，记记录录色色谱谱图图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%头孢呋辛酯中头孢呋辛酯中有关物质和异构体有关物质和异构体的检查的检查 色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验：测定头孢呋辛酯的HPLC系统为ODS分析柱分析柱；mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278 nm。要求头孢呋辛头孢呋辛酯酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯异构体之间，头孢呋辛酯A异构体异构体与头孢呋辛酯与头孢呋辛酯2-异构体之间的异构体之间的分离度应分离度应大于大于；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500异构体异构体 取本品适量，配制成每1mlmg的甲醇-流动相(11)的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的异构体峰的相对保留时间约为相对保留时间约为0.85，A。供试品色谱图中供试品色谱图中A异构体峰的面积与异构体峰的面积与A、B。40020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401 有关物质有关物质 取本品适量，精密称定，加流动相制成每每1mlmg的溶液，作为供试品溶液的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成每每1ml中约含中约含6 g的溶液，的溶液，作为对照溶液作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积5.含量测定含量测定1）碘量法（碘量法（ChP2000）原理：原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其应，但其碱性降解产物可消耗碘碱性降解产物可消耗碘青霉素族头孢菌素族NaOH水解4I2H+8I-I2+2Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6定量过量定量过量剩余剩余反应分两步进行：反应分两步进行：水解反应水解反应 (按化学计算量进行按化学计算量进行)氧氧化化-还还原原反反应应 (无无定定量量关关系系，受受温温度度、pH值值和和时时间间等等因因素素影影响响，应应严严格格控控制制反反应应条件并采用标准品平行对照测定条件并采用标准品平行对照测定)空白试验空白试验因样品中杂质会消耗碘，故应作空白因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验试验 空白试验与经典空白试验不同：空白试验与经典空白试验不同：加入样品，不加碱加入样品，不加碱，其余试剂（醋酸，其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都加盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都加试验条件：（试验条件：（I2氧化）氧化）弱酸性（弱酸性（pH4.5）碱碱 I2 IO3-+I-酸酸 某些药物与碘生成复盐沉淀某些药物与碘生成复盐沉淀温度温度（2426）温度温度38 时时未水解未水解的供试品亦消耗碘的供试品亦消耗碘反应时间：（反应时间：（20分分钟）钟）20分钟后，分钟后，耗碘量随耗碘量随时间的变化较小时间的变化较小特点特点灵敏度高：灵敏度高：样品样品:碘碘 =1:8 =1:8反应条件、实验操作要求高反应条件、实验操作要求高含量含量1 1份含量份含量V对对、V对空对空V样样、V样空样空加试剂次序、反应时间、滴定速度相同加试剂次序、反应时间、滴定速度相同含量含量 对照品对照品 V样空样空 -V样样 W对对 V对空对空-V对对 W样样2）电位配位滴定法（汞量法）电位配位滴定法（汞量法）原理：原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+络和络和 Hg+2R-SH (RS)2Hg+2H+方法说明：方法说明：a 空白试验与碘量法类似，加样品，不加空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOH b 与碘量法相比，汞量法不需对照试验与碘量法相比，汞量法不需对照试验3）酸碱滴定法）酸碱滴定法4）硫醇汞盐法）硫醇汞盐法 青霉素青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐青霉烯酸硫醇汞盐5）羟肟酸比色法）羟肟酸比色法 内酰胺类内酰胺类 红红色色6）HPLC法：应用广泛法：应用广泛咪唑HgCl2（max 324345nm）NH2OHH+Fe3+阿莫西林克拉维酸钾片阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；g，加加水水900 ml溶溶解解，用用磷磷酸酸或或10mol/L氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液调调节节pH值值至至4.40.1，加加水水稀稀释释至至1000ml)-甲甲醇醇(95:(5为为流流动动相相ml/min；检测波长为220nm。测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每制成每1mlmgmg的混合溶液的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。三、氨基糖苷类三、氨基糖苷类链霉素链霉素 都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷 分子结构中都含有多羟基分子结构中都含有多羟基 均为碱性抗生素均为碱性抗生素1）碱性（氨基）：）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：）溶解度（氨基、羟基）：水溶性水溶性3）旋光性（糖）：）旋光性（糖）：多个手性碳多个手性碳4）稳定性（苷）：）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解强酸、碱条件均可水解1）茚三酮反应：）茚三酮反应：具羟基胺类具羟基胺类,-,-氨基酸性质氨基酸性质 链霉素链霉素+水和茚三酮水和茚三酮 蓝紫色蓝紫色2）N-甲基葡萄糖胺（甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：）反应：链霉素链霉素 N-甲基葡萄糖胺甲基葡萄糖胺 红色红色水解对二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮OH-3 3）麦芽酚（麦芽酚（Maltol)反应反应 (链霉糖特有）链霉糖特有）链霉素链霉素 麦芽酚麦芽酚 紫红色紫红色OH-重排Fe3+8-羟基喹啉 NaOBr或-萘酚 OH-水解4）坂口（）坂口（Sakaguchi）反应：）反应：(链霉胍特有）链霉胍特有）链霉素链霉素 链霉胍链霉胍 橙红橙红5）硫酸盐反应）硫酸盐反应4.检查检查1）链霉素中链霉素）链霉素中链霉素B的检查的检查 来源：发酵中产生来源：发酵中产生 BP：薄层色谱法（杂质对照品法）薄层色谱法（杂质对照品法）2）庆大霉素庆大霉素C C 组分测定组分测定 （系统适用性试验）（系统适用性试验）色谱柱：色谱柱：ODS 流动相：流动相：H2O-HAc-MeOH配制的配制的庚烷磺酸庚烷磺酸钠钠M)，必要时调节甲醇的含量，必要时调节甲醇的含量 检测波长：检测波长：330nm（邻苯二甲醛柱前衍生）邻苯二甲醛柱前衍生）要求：要求：NC2 2000，C2a峰和峰和C2峰的分离度应峰的分离度应符合要求，重复进样符合要求，重复进样RSD2.0%5.含量含量 微生物法、微生物法、HPLC法等法等四、四环素类四、四环素类1）两性：两性：-OH：酸性酸性 N(CH3)2：碱性碱性 与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐2 2）旋光性）旋光性3 3）UVUV和荧光：和荧光：4 4）与金属离子络合：）与金属离子络合：酚羟基、烯醇基与酚羟基、烯醇基与Ca2+、Mg2+络合显色络合显色5）稳定性）稳定性 易发生异构化易发生异构化,降解等反应降解等反应,性质不稳定性质不稳定弱酸性（弱酸性（pH2-6）A环环C-4异构化异构化 差向四环素差向四环素酸性（酸性（pH 2）C环脱水环脱水 脱水四环素脱水四环素 碱性碱性 C环开环，形成内酯环开环，形成内酯 异四环素异四环素 AApH2.06.0差向异构体DDDCBBCBC脱水四环素类异四环素OH-1）浓硫酸反应）浓硫酸反应2）FeCl3反应：反应：（酚羟基酚羟基）显红色显红色褐色褐色3）TLC、HPLC4）荧光：）荧光：（含共轭双键）含共轭双键）紫外灯照射下产生不同颜色荧光紫外灯照射下产生不同颜色荧光4.检查检查 TLC、HPLC法法 杂质吸收度（降解产物颜色较深）杂质吸收度（降解产物颜色较深）ChP、USP：HPLC法法 JP：比色法比色法五、高分子杂质的检查五、高分子杂质的检查内源性：药物自身聚合物内源性：药物自身聚合物 来源于生产过程、贮存过程、使用不当来源于生产过程、贮存过程、使用不当外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物 来源于发酵过程来源于发酵过程高分子杂质高分子杂质高分子杂质控制方法高分子杂质控制方法凝胶色谱法：葡聚糖凝胶凝胶色谱法：葡聚糖凝胶 Sephadex G-10 Sephadex G-10