《蛋白纯化系统》PPT课件.ppt

27 十月 2022BioLogic DuoFlow中高压层析系统层层析原理与操作析原理与操作为为什么做蛋白什么做蛋白质纯质纯化？化？原理与操作原理与操作纯度均一的蛋白质才能满足物理化学性质研究、生物活性测定、免疫学性质、结构分析、药理毒理实验的要求，以揭示生命科学的规律。研究开发、中试生产蛋白质药物用于诊断和治疗。实验实验室研究室研究A、天然生物样品纯度均一的蛋白质纯纯化化B、重组基因工程药物C、蛋白质组研究差异蛋白质质谱测序克隆表达分离纯化蛋白质是生命科学研究的基本且必要的技术手段，也是生物制品药物生产的最重要的工艺步骤！其他生物分子分离其他生物分子分离纯纯化化原理与操作原理与操作其他生物大分子：其他生物大分子：DNA，多糖，多糖生物小分子：多生物小分子：多肽肽和小和小肽肽，核苷酸，寡糖和，核苷酸，寡糖和单单糖，多糖，多环环和和杂环杂环用途：用途：用于性用于性质质、活性等研究需要、活性等研究需要用于治用于治疗疗和和诊诊断的断的药药物物用于生物、化工或食品等用于生物、化工或食品等轻轻工工领领域的生化域的生化试剂试剂离心离心沉淀沉淀超超滤滤电电泳泳层层析析(Chromatography)生物分离生物分离纯纯化技化技术术原理与操作原理与操作Model 491，RotoforNote:蛋白质分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件，从而保证在此过程中蛋白质的结构和活性不受影响。最广泛的蛋白质分离纯化方法最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质空间结构与活性什么是生物什么是生物层层析析 根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ionic characteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同生物分子分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作原理与操作层层析技析技术术 Ion Exchange(IEX)离子交离子交换换电荷 可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化Size Exclusion(SEC)分子分子筛筛（或凝胶（或凝胶过滤过滤）分子大小 用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化Affinity(AC)亲亲和和生物相互作用 用于复杂样品的最早捕获或中间纯化Hydrophobic Interaction(HIC和和RP)疏水和反相疏水和反相疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖Ceramic Hydroxyapatite(CHT)&Ceramic Fluoroapatite(CFT)羟羟基磷灰石基磷灰石独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化原理与操作原理与操作层层析的析的5个操作步个操作步骤骤装柱并平衡装柱并平衡上上样样平衡平衡洗脱洗脱再生再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作原理与操作原理与操作原理与操作层层析析图图第一峰第一峰,外水体外水体积积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。流出。这这是是样样品中的未品中的未结结合物合物质质VoVeVt蛋白蛋白质质含量含量(A280),由由UV检测检测器器读读出，出，y轴轴基基线线洗脱峰，有些可以很好的分离，有洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉些分得不是很好，有部分交叉时间时间或体或体积积，x轴轴液相液相层层析系析系统统的工作流程的工作流程用用用用PumpPump推推推推动动动动溶液溶液溶液溶液各种各种各种各种ValveValve系系系系统选统选统选统选取溶液控制流取溶液控制流取溶液控制流取溶液控制流向向向向通通通通过过过过 ColumnColumn 时时时时不同蛋白分子与不同蛋白分子与不同蛋白分子与不同蛋白分子与填料作用填料作用填料作用填料作用强强强强度不同因而迁移速度不同因而迁移速度不同因而迁移速度不同因而迁移速度不同从而分开度不同从而分开度不同从而分开度不同从而分开Column Column 洗脱液包含的蛋白洗脱液包含的蛋白洗脱液包含的蛋白洗脱液包含的蛋白 .通通通通过过过过检测检测检测检测器器器器确定位置和确定位置和确定位置和确定位置和浓浓浓浓度度度度Fraction CollectorFraction Collector收集收集收集收集样样样样品品品品原理与操作原理与操作液相液相层层析系析系统统仪仪器器结结构构DuoFlow 10/40系统DuoFlow 工作站工作站电导检测器电导检测器MX-1 梯度混合器梯度混合器AVR7-3 样品进样阀样品进样阀USB Bitbus 信号转换器信号转换器液晶显示器液晶显示器电脑电脑BioFrac方形方形组分收集器组分收集器UV 检测器检测器DuoFlow中高压层析系统中高压层析系统Maximizer阀系统阀系统QuadTec 紫外紫外/可见检测器可见检测器Maximizer 混合器混合器SV5-4 阀阀AVR9-8 阀阀pH 检测器检测器DuoFlow Basic DuoFlow QuadTec Maximizer Pathfinder DuoFlow中高压层析系统中高压层析系统工作流程工作流程DuoFLow生物相容性生物相容性生物相容性生物相容性100%bio-compatible100%bio-compatible所有接触溶液的系统以新型塑料所有接触溶液的系统以新型塑料所有接触溶液的系统以新型塑料所有接触溶液的系统以新型塑料peekpeek为为为为主主主主溶液系统不接触任何金属件，避免蛋白变溶液系统不接触任何金属件，避免蛋白变溶液系统不接触任何金属件，避免蛋白变溶液系统不接触任何金属件，避免蛋白变性和吸附性和吸附性和吸附性和吸附化学稳定性化学稳定性化学稳定性化学稳定性化学稳定性化学稳定性化学稳定性化学稳定性基本特征基本特征DuoFLow兼容所有层析填料兼容所有层析填料兼容所有层析填料兼容所有层析填料基本特征基本特征DuoFLowF10F10梯度泵：梯度泵：梯度泵：梯度泵：20.0 ml/min at 20.0 ml/min at 3500psi(233 bar,23MPa)3500psi(233 bar,23MPa)高压中流速的泵头可满足HPLC高压液相分析和小规模制备的要求F40F40梯度泵：梯度泵：梯度泵：梯度泵：80 ml/min 80 ml/min at 1000psi(66bar,6.6 MPa)at 1000psi(66bar,6.6 MPa)中压高流速的泵头可满足大规模制备，包括中试和生产的要求DuoFLow特色特色:可更换的双泵头可更换的双泵头只要旋下泵头前的4根螺丝，将另一泵头安上即可实现高压中流速和中压高流速的切换DuoFlow可将高压中流速和中压高流速两种仪器的可将高压中流速和中压高流速两种仪器的性能通过独特的泵头更换技术整合在一台仪器中。性能通过独特的泵头更换技术整合在一台仪器中。灵活多样、功能强大灵活多样、功能强大的扩展配置的扩展配置DuoFLow特色特色Easy to learn Software强大的分析、管理和报告功能，强大的分析、管理和报告功能，强大的分析、管理和报告功能，强大的分析、管理和报告功能，通过软件整合和控制所有硬件通过软件整合和控制所有硬件通过软件整合和控制所有硬件通过软件整合和控制所有硬件:Maximizer,QuadTec,Maximizer,QuadTec,2128,BioFrac,2128,BioFrac,pH Monitor,all valvespH Monitor,all valvesDuoFLow特色特色MaximizerMaximizer使F10和F40梯度泵流速增加一倍，压力不变情况下达到20 ml/min or 80 ml/min，用于工艺优化、中试放大四元缓冲液梯度混合，寻找最佳PH和离子强度以优化工艺增加阀的数量，达到6低压6高压阀，灵活配置你的层析系统连接第三方检测器DuoFLow功能组件功能组件MaximizerMaximizerDuoFLow功能组件功能组件PeekPeek材质，良好化学稳定性材质，良好化学稳定性材质，良好化学稳定性材质，良好化学稳定性密封的甘汞电极防止电极液干涸密封的甘汞电极防止电极液干涸密封的甘汞电极防止电极液干涸密封的甘汞电极防止电极液干涸甘汞不与混冲液中的金属离子结合，甘汞不与混冲液中的金属离子结合，甘汞不与混冲液中的金属离子结合，甘汞不与混冲液中的金属离子结合，防止堵塞防止堵塞防止堵塞防止堵塞响应时间提高，检测结果更加准确响应时间提高，检测结果更加准确响应时间提高，检测结果更加准确响应时间提高，检测结果更加准确和精确和精确和精确和精确PH检测器检测器DuoFLow功能组件功能组件检测范围：pH014检测灵敏度：UV、电导检测器、电导检测器标配标配标配标配254/280 nm254/280 nm滤光片检测滤光片检测滤光片检测滤光片检测DNADNA、蛋白、蛋白、蛋白、蛋白214 nm+214 nm+锌灯选件检测肽链锌灯选件检测肽链锌灯选件检测肽链锌灯选件检测肽链滤光片选件滤光片选件滤光片选件滤光片选件313 nm313 nm356 nm356 nm405 nm405 nm436 nm436 nm546 nm 546 nm 外接其它检测器，如折光仪外接其它检测器，如折光仪外接其它检测器，如折光仪外接其它检测器，如折光仪DuoFLow功能组件功能组件QuadTec UV/Vis 检测器同时四波长检测 DNA,peptides,ProteinsDuoFLow功能组件功能组件波长范围：190-740nm四波长同步检测波长精确性：1nmWavelengthAbsorbing Species206 nm214 nm224 nm245 nm254 nm260 nm280 nm313 nm365 nm405 nm550 nmCarboxyl groups,ester links,amide or peptide bondsPeptide bondsPeptide bondsProteins in the presence of Trion X-100Nucleotides,Nucleotide Bases,DNA,RNANucleotides,Nucleotide Bases,DNA,RNAProteins with Aromatic amino acidsCertain Vitamins,Antibiotics with Conjugated ring systemsSome steroids,NADH,NADPH,flavoproteins,bacteriochlorophylls with Conjugated ring systemsMyoglobin with Heme groupCytochromesDuoFLow功能组件功能组件QuadTec1414种可选收集架，可以放冰浴，保种可选收集架，可以放冰浴，保种可选收集架，可以放冰浴，保种可选收集架，可以放冰浴，保证样品活性证样品活性证样品活性证样品活性整合在整合在整合在整合在duoflowduoflow中，多种程序中，多种程序中，多种程序中，多种程序(窗窗窗窗口和阀限口和阀限口和阀限口和阀限)收集收集收集收集可用在可用在可用在可用在HR,LP,EconoHR,LP,Econo中中中中BioFrac Fraction BioFrac Fraction 组分收集器组分收集器组分收集器组分收集器DuoFLow功能组件功能组件DuoFLow功能组件功能组件BioFrac Fraction BioFrac Fraction 组分收集器组分收集器组分收集器组分收集器Make-before-break 高压阀高压阀 AVR7-3 AVR7-3 高压上样阀高压上样阀高压上样阀高压上样阀AVR9-8 AVR9-8 高压转换阀高压转换阀高压转换阀高压转换阀各种低压阀各种低压阀SV5-4SV5-4低压阀，缓冲液选择低压阀，缓冲液选择低压阀，缓冲液选择低压阀，缓冲液选择SVT3-2SVT3-2低压阀，溶液选择低压阀，溶液选择低压阀，溶液选择低压阀，溶液选择或转向或转向或转向或转向灵活应用各种阀和辅助泵构建灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统随意层析系统DuoFLow功能组件功能组件阀系统阀系统2xAVR7-3阀构建阀构建逆向层析系统，逆向层析系统，用于亲和层析用于亲和层析仅需切换第二仅需切换第二个个AVR7-3阀位阀位置即可置即可DuoFLow阀系统阀系统2xAVR9-8实现实现8柱切换柱切换DuoFLow阀系统阀系统DuoFLow阀系统阀系统AVR9-8辅助泵辅助泵实现自实现自动切换动切换上样上样DuoFLow阀系统：柱串联阀系统：柱串联去除血清中高丰度蛋去除血清中高丰度蛋白：白：IgG和和HSA以用于以用于2D电泳分析电泳分析DuoFLow阀系统：柱串联阀系统：柱串联利用各种阀构建利用各种阀构建级联层析系统，级联层析系统，实现特定目的实现特定目的A:A:样品经阀样品经阀样品经阀样品经阀1 1 柱柱柱柱1 1 阀阀阀阀3 3 阀阀阀阀4 4 收集器收集器收集器收集器B:B:特定组份经阀特定组份经阀特定组份经阀特定组份经阀4 4 阀阀阀阀2 2Loop Loop 柱柱柱柱2 2 阀阀阀阀3 3、4 4 收集器收集器收集器收集器前一柱子流出的特定前一柱子流出的特定前一柱子流出的特定前一柱子流出的特定组份直接上第二根柱组份直接上第二根柱组份直接上第二根柱组份直接上第二根柱子二次分离子二次分离子二次分离子二次分离DuoFLow阀系统阀系统阀系统：阀系统：2D-LC（Liquid Chromatography）样品：蛇毒样品：蛇毒1D Column：Uno Q强阴离子交换柱强阴离子交换柱2D Column：Hi-Pore RP 318 C18反反相分析柱相分析柱1D柱第柱第11组分由阀门导向样品环中，组分由阀门导向样品环中，继续继续1D色谱分析，完毕后，自动进行色谱分析，完毕后，自动进行2D反相柱的平衡，然后进样（反相柱的平衡，然后进样（1D第第11组分），进行组分），进行2D反相分析。反相分析。第一维色谱，UNO Q1离子交换第二维色谱，RP C18反相，第一维11管组分在第二维分成多个组分第一维第11管组分1mL经过检测器后没流到收集器中，而是流到第二维色谱的进样环中，所以以空白表示，没标以灰色DuoFLow3XAVR7-3实现三柱级联实现三柱级联前一柱子未结合的蛋白进入第前一柱子未结合的蛋白进入第前一柱子未结合的蛋白进入第前一柱子未结合的蛋白进入第二、三根柱子，三根柱子可以二、三根柱子，三根柱子可以二、三根柱子，三根柱子可以二、三根柱子，三根柱子可以独立洗脱独立洗脱独立洗脱独立洗脱第一根柱子独立上样、洗脱，第一根柱子独立上样、洗脱，第一根柱子独立上样、洗脱，第一根柱子独立上样、洗脱，组份经换向阀进入第二根柱子，组份经换向阀进入第二根柱子，组份经换向阀进入第二根柱子，组份经换向阀进入第二根柱子，独立洗脱，组份经换向阀进入独立洗脱，组份经换向阀进入独立洗脱，组份经换向阀进入独立洗脱，组份经换向阀进入多三根柱子，独立洗脱收集多三根柱子，独立洗脱收集多三根柱子，独立洗脱收集多三根柱子，独立洗脱收集DuoFLow阀系统阀系统BioLogic DuoFlow Basic SystemBioLogic DuoFlow Basic SystemBioLogic DuoFlow Standard SystemBioLogic DuoFlow Standard SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Basic SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Basic SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Standard SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Standard SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 20 SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 20 SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 80 SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 80 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 20 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 20 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 80 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 80 System 一套组件，根据需要配置多种平台，一套组件，根据需要配置多种平台，组件共享，资源共享组件共享，资源共享DuoFLowDuoFLow软件系统软件系统非常直观，易学非常直观，易学非常直观，易学非常直观，易学简单明快，4个步骤进入操作：Browser Setup Protocol Run观察样品情况,调节色普图和峰高度or Go Do Something Else!2 次击键进入操作:Browser Run观察样品情况,调节色普图和峰高度or Go Do Something Else!DuoFLow软件系统软件系统Manual ScreenDuoFLow软件系统软件系统Browser Enter User and Method Name DuoFLow软件系统软件系统Setup select hardwareDuoFLow软件系统软件系统Protocol enter methodDuoFLow软件系统软件系统Post Run Options-Activity DuoFLow软件系统软件系统Post Run OptionsPeak TaggingDuoFLow软件系统软件系统Post Run Options TRACE COMPARE TRACE COMPARE 层析图比较层析图比较层析图比较层析图比较 单一柱子单一程序走不同样品单一柱子单一程序走不同样品单一柱子单一程序走不同样品单一柱子单一程序走不同样品单一样品和单一程序走不同柱子单一样品和单一程序走不同柱子单一样品和单一程序走不同柱子单一样品和单一程序走不同柱子同一样品和柱子走不同程序同一样品和柱子走不同程序同一样品和柱子走不同程序同一样品和柱子走不同程序DuoFLow软件系统软件系统DuoFLow软件系统软件系统DuoFLow软件系统软件系统液相液相层层析系析系统统应应用用层析是如何物质实现分类层析是如何物质实现分类 根据分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ionic characteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离 层析技术在大分子分离纯化的应用层析技术在大分子分离纯化的应用抗体制备生产以及免疫学研究层析技术酶工业生产以及酶学研究蛋白质结构和功能研究其他研究的进行组分分离或者样品制备等其他生物活性分子功能研究蛋白质结构功能研究方面蛋白质结构功能研究方面一、结构生物学和蛋白质功能研究均需要高纯度的蛋白质二、层析技术是蛋白质纯化最好的手段三、层析技术能够满足样品的高纯度、高活性的要求蛋白质结构生物学研究策略蛋白质结构生物学研究策略 选择基因表达载体构建纯化目的蛋白 蛋白质结晶组织提取基因工程细胞表达.多维核磁共振X射线解析结构数据收集 利用层析进行蛋白质纯化是蛋白质研究的基础层析技术在抗体生产中的应用层析技术在抗体生产中的应用细胞培养细胞去除亲和捕获精纯过滤除菌层析纯化层析技术是纯化捕获抗体的最佳手段层析技术在天然产物分离和中医学层析技术在天然产物分离和中医学上的应用上的应用中草药活性组分分离的研究中草药活性组分药理研究中草药活性成分与蛋白质相互作用以及治疗机理的研究 分离技分离技术术扮演中扮演中药药角色角色层析技术在天然产物分离和中医学上的应用中草药活性成分在生命科学中中草药活性成分在生命科学中的定位的定位 基因组基因组 蛋白质组蛋白质组次生代谢产物组次生代谢产物组DNARNA蛋白质（酶）蛋白质（酶）次生代谢产物次生代谢产物基因工程药物基因工程药物中药活性成分中药活性成分天然产物活性成分天然产物活性成分色谱色谱液相液相层层析系析系统统注意事注意事项项1.仪器使用过程中常遇到如下问题：压力读数或流量脉动，可能是气泡滞陷在泵头，参考仪器手册赶出气泡；紫外基线脉动或噪音过大，可能是气泡滞陷在检测池；反压过大，可能是管道堵塞或柱子需要清洗。取下柱子，如果反压仍过大，需清洗管道和阀门（可以从泵开始逐段检查找出堵塞处），否则按柱子说明书清洗或再生柱子。2.最好联系仪器管理员处理有关问题。如果问题仍不能解决，拨打Bio-Rad 维修热线800-820-5567。常见问题处理常见问题处理