《生物化学技术实验》PPT课件.ppt

生物化学技术实验部分生物化学技术实验部分(2010版版)生物化学研究的核心任务：生物化学研究的核心任务：阐明阐明生命现象生命现象的的分子机理分子机理。生物大分子物质制备的基本过程：生物大分子物质制备的基本过程：确定测定方法确定测定方法确定测定方法确定测定方法 材料的选择与处理材料的选择与处理材料的选择与处理材料的选择与处理 抽提抽提抽提抽提 浓缩浓缩浓缩浓缩 纯化纯化纯化纯化 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析电电电电 泳泳泳泳前处理前处理前处理前处理浓缩、粗分离浓缩、粗分离浓缩、粗分离浓缩、粗分离细分离细分离细分离细分离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心、过滤解、差速离心、过滤沉淀法沉淀法沉淀法沉淀法亲和亲和亲和亲和层析层析层析层析离子交离子交离子交离子交换层析换层析换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶凝胶凝胶过滤过滤过滤过滤吸附吸附吸附吸附层析层析层析层析蛋白质的制备：蛋白质的制备：蛋白质的制备：蛋白质的制备：一、蛋白质的性质：一、蛋白质的性质：（1 1）两性解离的性质：）两性解离的性质：）两性解离的性质：）两性解离的性质：pIpI（2 2）胶体性质：）胶体性质：）胶体性质：）胶体性质：不能通过半透膜不能通过半透膜不能通过半透膜不能通过半透膜（3 3）具有沉淀作用：）具有沉淀作用：）具有沉淀作用：）具有沉淀作用：等电点沉淀法、盐析法和有机溶等电点沉淀法、盐析法和有机溶等电点沉淀法、盐析法和有机溶等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等剂沉淀法等剂沉淀法等剂沉淀法等（4 4）变性、复性）变性、复性）变性、复性）变性、复性（5 5）紫外吸收）紫外吸收）紫外吸收）紫外吸收二、分离纯化蛋白质的主要方法二、分离纯化蛋白质的主要方法（一）根据溶解度差异分离：选择性沉（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法淀法 等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 利用生化物质在不同浓度利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法的方法。降低水活性，使溶液的降低水活性，使溶液的介电常数介电常数下降，增加下降，增加蛋白质溶质蛋白质溶质分子之分子之间间的作用力，因而聚集在一起。的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein有机溶剂沉淀法Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+-+-+-+-+-+-+-有机溶剂Solvent%=hydrophilic有机溶液沉淀法的优缺点有机溶液沉淀法的优缺点优点优点分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。缺点缺点易使某些蛋白质或酶变性。易使某些蛋白质或酶变性。常用的有机溶剂常用的有机溶剂乙醇、丙酮乙醇、丙酮丙酮沉淀能力比较强丙酮沉淀能力比较强用有机溶剂沉淀法时应注意的问题用有机溶剂沉淀法时应注意的问题 温度的控制温度的控制有机溶剂的选择有机溶剂的选择pH值的选择值的选择离子强度的选择离子强度的选择分离溶液浓度的控制分离溶液浓度的控制及时处理沉淀物及时处理沉淀物温度的控制温度的控制全全部部操操作作过过程程应应在在低低温温条条件件进进行行，而而且且最最好好在在同同一温度一温度下进行。下进行。加入的有机溶剂温度要加入的有机溶剂温度要预冷预冷。pH值的选择值的选择pH值值影影响响蛋蛋白白质质在在有有机机溶溶剂剂中中溶溶解解度度，分分级级沉沉淀淀时时更更应应严严格格控控制制pH值值。应应选选择择pH值在等电点（值在等电点（PI）附近。）附近。离子强度的选择离子强度的选择离离子子强强度度达达到到一一定定程程度度时时，能能增增加加蛋蛋白白质质或或酶酶在在有有机机溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度。离离子子强强度度为为好好，过大则需更多的有机溶剂来沉淀。过大则需更多的有机溶剂来沉淀。由由盐盐析析法法沉沉淀淀得得到到的的蛋蛋白白质质或或酶酶，用用有有机机溶溶剂沉淀前，一定要剂沉淀前，一定要先透析除盐先透析除盐。分离溶液浓度的控制分离溶液浓度的控制蛋蛋白白质质浓浓度度愈愈大大，加加入入有有机机溶溶剂剂后后，蛋蛋白白质质沉淀量就愈多。沉淀量就愈多。蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机溶蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。剂用量。浓度过大，共沉淀现象增加，浓度过大，共沉淀现象增加，不利于分级沉不利于分级沉淀。淀。及时处理沉淀物及时处理沉淀物沉淀物要立即用水或缓冲液溶解，沉淀物要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。降低有机溶剂的浓度。（二）、根据（二）、根据 分子大小和形状的差异分子大小和形状的差异分离分离透析和超滤法：除去小分子物质透析和超滤法：除去小分子物质半透膜阻留半透膜阻留pr分子，分子，而让小的溶质分子和而让小的溶质分子和水通过，以达到除去水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。（盐、低分子酸等）。施以一定的压力使小施以一定的压力使小分子溶质通过一半透分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋孔大小截留相应的蛋白质分子白质分子沉降的速度与颗粒的大小沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。和密度有关。离心后按其离心后按其沉降的速度不同，彼此分沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采定位，针刺或冰冻切片采样分析样分析密度梯度离心法密度梯度离心法 凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（介质：交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P，），）琼琼 脂脂 糖糖 凝凝 胶胶（Sepharose，Bio-Gel A）凝胶过滤法凝胶过滤法支持物的选择：支持物的选择：（三）（三）根据电荷性质的差异分离根据电荷性质的差异分离 1、电泳和等电聚焦法：、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、脉冲电泳、毛细管电泳毛细管电泳支持物支持物：PAGE、琼脂糖胶等、琼脂糖胶等PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)Molecules are separated by size and charge in an electric field.IsoelectricFocusingreliesonthemigrationofchargedproteinsinanelectricfield等电聚焦法等电聚焦法 2、离子交换层析法、离子交换层析法 基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂电荷基团：电荷基团：阳离子交换剂阳离子交换剂 （四）（四）配体亲和力的差异配体亲和力的差异：亲和层析亲和层析 利利利利用用用用生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子能能能能和和和和其其其其配配配配体体体体（例例例例：酶酶酶酶和和和和抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂，抗抗抗抗原原原原和和和和抗抗抗抗体体体体，激激激激素素素素和和和和受受受受体体体体）通通通通过过过过次次次次级级级级键键键键专专专专一一一一性性性性结结结结合合合合，而而而而在在在在一一一一定定定定的的的的条条条条件件件件下下下下又又又又可可可可解解解解离离离离的的的的原原原原理理理理进进进进行行行行层析的方法。层析的方法。层析的方法。层析的方法。用用用用这这这这种种种种层层层层析析析析方方方方法法法法，一一一一次次次次可可可可将将将将物物物物质质质质提提提提得得得得很很很很纯纯纯纯，是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。亲和层析作用机理亲和层析作用机理：(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB配体配体XBAA亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备分离纯化一定数量的游离配体载体活化配体与载体偶联Activity亲和层析图谱：ElutionvolumeProtein*（五）（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography)HPLCHPLC的特点：的特点：1.1.支持介质颗粒细，比表面积大。支持介质颗粒细，比表面积大。2.2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。HPLCHPLC是一项快速、灵敏、高效的分离技术。是一项快速、灵敏、高效的分离技术。纯化方案的评价比活力：比活力：比活力：比活力：活力单位数活力单位数活力单位数活力单位数/mg/mg蛋白蛋白蛋白蛋白纯化倍数：纯化倍数：纯化倍数：纯化倍数：每步的比活力每步的比活力每步的比活力每步的比活力/粗抽提液的比活力粗抽提液的比活力粗抽提液的比活力粗抽提液的比活力回收率：回收率：回收率：回收率：每步的总活力每步的总活力每步的总活力每步的总活力/粗提液的总活力粗提液的总活力粗提液的总活力粗提液的总活力 100%100%亲和层析纯化胰蛋白酶手脑并用，知行合一胰蛋白酶的制备 目目前前工工业业上上提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶主主要要有有二种途径：二种途径：1 1、从动物胰脏中直接提取。、从动物胰脏中直接提取。2 2、从猪胰残渣中提取。、从猪胰残渣中提取。胰蛋白酶胰蛋白酶的性质的性质 胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶在在在在时时时时最最最最为为为为稳稳稳稳定定定定，低低低低于于于于此此此此pHpHpHpH时时时时酶酶酶酶易易易易变变变变性性性性；当高于当高于当高于当高于以上时，酶易自溶而会失去活性。以上时，酶易自溶而会失去活性。以上时，酶易自溶而会失去活性。以上时，酶易自溶而会失去活性。提提提提取取取取制制制制备备备备胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶的的的的全全全全部部部部过过过过程程程程中中中中应应应应注注注注意意意意溶溶溶溶液液液液的的的的pHpHpHpH值值值值以以以以及及及及在在在在冷冷冷冷室室室室（0 0 0 0一一一一5555）中中中中进进进进行行行行操操操操作作作作为为为为宜。宜。宜。宜。胰蛋白酶是以无活性的酶原形胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原先正常生理条件下，胰蛋白酶原先正常生理条件下，可以被肠激酶、钙离子所激活或可以被肠激酶、钙离子所激活或自我活化成为有活力的酶。自我活化成为有活力的酶。猪胰蛋白酶原分子量为猪胰蛋白酶原分子量为24-25kDa24-25kDa之间，而猪胰蛋白酶原激活后，之间，而猪胰蛋白酶原激活后，N-N-端端丢失个丢失个6 6肽，分子量变为，分子构肽，分子量变为，分子构象发生了一定的改变，象发生了一定的改变，pIpI变为。变为。胰蛋白酶对胰蛋白酶对R1=ArgR1=Arg和和LysLys肽肽键具有键具有选择性水解作用选择性水解作用，将蛋白，将蛋白质水解为质水解为多肽多肽或或氨基酸氨基酸。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2 由由于于血血清清含含有有非非特特异异性性胰胰蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂，使使胰胰蛋蛋白白酶酶不不会会消消化化正常组织。正常组织。在在胰胰脏脏、鸡鸡蛋蛋清清和和大大豆豆中中，都都含有相当量的含有相当量的胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶不仅能够水解胰蛋白酶不仅能够水解Arg和和Lys羧基所组成的羧基所组成的肽键肽键，而且也，而且也能水解能水解酰胺键酰胺键和和酯键酯键。对其催化。对其催化水解活性的敏感度为：水解活性的敏感度为：酯键酰胺键肽键 胰胰蛋蛋白白酶酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)和和弹性蛋白酶三三种种酶酶在在理理化化性性质质和和结结构构上上均均十十分分接接近近，利利用用一一般般常常用用的的提提取取分分离离方方法法，很很难难将将它它们们之之间间彼彼此此彻彻底底分分开开。为为了了获获得得高高纯纯度度的的胰胰蛋蛋白白酶酶制制品品，采采用用亲和层折技术进进一一步步纯纯化化后后，可可达达到到十十分满意的效果。分满意的效果。胰蛋白酶的天然抑制剂胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵类粘蛋白(CHOM)CHOMCHOM在中性及偏酸性溶液中对热及在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂有较高的耐受性，在高浓度的脲、有机溶剂有较高的耐受性，在碱性条件下易变性，在碱性条件下易变性，在50%50%的丙酮或者的丙酮或者10%10%三氯醋酸溶液中仍然有较好的溶解度。三氯醋酸溶液中仍然有较好的溶解度。因因此此选选择择合合适适的的pHpH值值、丙丙酮酮或或三三氯氯醋醋酸酸的的浓浓度度，可可以以从从鸡鸡蛋蛋清清中中除除去去大大量量的的非非卵卵类粘蛋白，从而获得较纯的类粘蛋白，从而获得较纯的CHOMCHOM。CHOM的理化性质的理化性质（分离纯化的依据）（分离纯化的依据）CHOMCHOMCHOMCHOM是是是是一一一一种种种种糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白，存存存存在在在在于于于于鸡鸡鸡鸡蛋蛋蛋蛋清清清清中中中中，是是是是一一一一种种种种专专专专一一一一性性性性很很很很强强强强的的的的胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶的的的的抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂。CHOMCHOMCHOMCHOM对对对对猪猪猪猪和和和和牛牛牛牛的的的的胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶有有有有很很很很强强强强的的的的抑制作用，而对糜蛋白酶无抑制作用。抑制作用，而对糜蛋白酶无抑制作用。抑制作用，而对糜蛋白酶无抑制作用。抑制作用，而对糜蛋白酶无抑制作用。在在在在的的的的范范范范围围围围内内内内，猪猪猪猪或或或或牛牛牛牛的的的的胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶能能能能牢牢牢牢固固固固地地地地吸吸吸吸附附附附在在在在CHOMCHOMCHOMCHOM上上上上，在在在在的的的的范范范范围围围围内内内内，又又又又能从能从能从能从CHOMCHOMCHOMCHOM上被上被上被上被洗脱洗脱洗脱洗脱下来。下来。下来。下来。CHOM的性质的性质（作为亲和层析配体纯化胰蛋白酶的依据）（作为亲和层析配体纯化胰蛋白酶的依据）一分子的一分子的CHOMCHOM能抑制一分子的胰蛋白酶。能抑制一分子的胰蛋白酶。1mg1mg鸡卵类粘蛋白能抑制胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白能抑制胰蛋白酶。采采采采用用用用鸡鸡鸡鸡卵卵卵卵类类类类粘粘粘粘蛋蛋蛋蛋白白白白作作作作为为为为配配配配基基基基合合合合成成成成亲亲亲亲和和和和吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂，可可可可以以以以从从从从猪猪猪猪胰胰胰胰脏脏脏脏的的的的粗粗粗粗提提提提液液液液中中中中，通通通通过过过过亲亲亲亲和和和和层层层层析析析析柱柱柱柱直直直直接接接接获获获获得得得得纯纯纯纯度度度度很很很很高高高高的的的的猪猪猪猪胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶。比比比比活活活活力力力力常常常常常常常常可可可可以以以以达达达达到到到到15000-20000 15000-20000 15000-20000 15000-20000 BAEEBAEEBAEEBAEE单单单单位位位位/mg/mg/mg/mg蛋蛋蛋蛋白白白白，相相相相当当当当于于于于五五五五次次次次重重重重结结结结晶晶晶晶的的的的胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶，纯纯纯纯化化化化效效效效率率率率可可可可提提提提高高高高10-2010-2010-2010-20倍。倍。倍。倍。亲和层析纯化胰蛋白酶的效果亲和层析纯化胰蛋白酶的效果胰蛋白酶胰蛋白酶活性的测定活性的测定及及CHOMCHOM抑制活性的测定抑制活性的测定 在任何蛋白质纯化过程中，关在任何蛋白质纯化过程中，关键的第一步是建立自始至终都要键的第一步是建立自始至终都要用的测活方法，这是策略上要作用的测活方法，这是策略上要作的最重要的决定，测活方法应始的最重要的决定，测活方法应始终是可信的。终是可信的。胰蛋白酶除了能水解蛋白质中碱性氨基酸胰蛋白酶除了能水解蛋白质中碱性氨基酸胰蛋白酶除了能水解蛋白质中碱性氨基酸胰蛋白酶除了能水解蛋白质中碱性氨基酸的羧基与其它氨基酸所组成的肽键外，还能的羧基与其它氨基酸所组成的肽键外，还能的羧基与其它氨基酸所组成的肽键外，还能的羧基与其它氨基酸所组成的肽键外，还能水解碱性氨基酸所组成的酯键。水解碱性氨基酸所组成的酯键。水解碱性氨基酸所组成的酯键。水解碱性氨基酸所组成的酯键。胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶也也也也能能能能催催催催化化化化由由由由碱碱碱碱性性性性氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸的的的的羧羧羧羧基基基基所所所所形形形形成成成成的的的的酯酯酯酯键键键键和和和和酰酰酰酰胺胺胺胺键键键键，而而而而其其其其高高高高度度度度的的的的专专专专一一一一性性性性仍仍仍仍表现为对表现为对表现为对表现为对碱性氨基酸的羧基一侧的选择。碱性氨基酸的羧基一侧的选择。碱性氨基酸的羧基一侧的选择。碱性氨基酸的羧基一侧的选择。依依 据据 底物：底物：底物：底物：N-N-苯甲酰苯甲酰L L一精氨酸乙酯一精氨酸乙酯（简称（简称 BAEEBAEE）BAEEBAEE在在在在胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶催催催催化化化化下下下下水水水水解解解解成成成成N-N-苯苯甲甲酰酰L L一一精精氨氨酸酸（简简称称 BABA），BAEEBAEE在在在在波波波波长长长长253nm253nm下下下下的的的的紫紫紫紫外外外外光光光光吸吸吸吸收收收收远远远远远远远远弱弱弱弱于于于于BABA，随随随随着着着着BABABABA逐逐逐逐渐渐渐渐增增增增多多多多，反反反反应应应应体体体体系系系系在在在在波波波波长长长长253nm253nm253nm253nm下下下下的的的的紫紫紫紫外外外外光光光光吸吸吸吸收收收收亦亦亦亦随随随随之之之之相相相相应应应应增增增增加加加加，用用用用紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收法法法法测测测测定定定定BABA的的的的增增增增加加加加，可可可可以以以以作作作作为为为为测测测测定定定定胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶活活活活性及鸡卵类粘蛋白抑制活性的专一性方法。性及鸡卵类粘蛋白抑制活性的专一性方法。性及鸡卵类粘蛋白抑制活性的专一性方法。性及鸡卵类粘蛋白抑制活性的专一性方法。方方 法法胰蛋白酶的胰蛋白酶的BAEEBAEE单位定义为：单位定义为：在在 下下 列列 实实 验验 条条 件件 下下，引引 起起 每每 分分 钟钟 光光 吸吸 收收 值值A253nmA253nm增加的酶量。增加的酶量。底物（底物（BAEEBAEE）浓度为）浓度为1mmol/L1mmol/L 反应液为反应液为 光程光程1cm1cm 反应温度反应温度2525 波长波长253nm253nm ODOD值递增值递增1 1、以鸡蛋清为原料经过提取、分离、纯化等手段得到以鸡蛋清为原料经过提取、分离、纯化等手段得到一个纯度较高的胰蛋白酶的天然抑制剂一个纯度较高的胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵类粘蛋白鸡卵类粘蛋白（简称（简称CHOMCHOM），以猪胰脏为原料经过提取、分离、激活），以猪胰脏为原料经过提取、分离、激活等步骤得到胰蛋白酶的粗提液。并且对所得到的鸡卵类粘等步骤得到胰蛋白酶的粗提液。并且对所得到的鸡卵类粘蛋白和猪胰蛋白酶的含量、纯度及其生物活性进行测定。蛋白和猪胰蛋白酶的含量、纯度及其生物活性进行测定。2 2、以以SEPHAROSE 4BSEPHAROSE 4B为载体经过活化，偶联合成一个为载体经过活化，偶联合成一个具有专一性的特殊配基具有专一性的特殊配基-卵类粘蛋白作为亲和吸附剂。卵类粘蛋白作为亲和吸附剂。3 3、用自己合成的亲和吸附剂，通过亲和层析技术得到非用自己合成的亲和吸附剂，通过亲和层析技术得到非常纯的猪胰蛋白酶。常纯的猪胰蛋白酶。实验内容提要实验内容提要实验流程 1.鸡卵类粘蛋白的制备鸡卵类粘蛋白的制备鸡卵类粘蛋白粗品的制备鸡卵类粘蛋白粗品的制备 鸡卵类粘蛋白粗品的精制鸡卵类粘蛋白粗品的精制2.亲和吸附剂的合成亲和吸附剂的合成载体的活化载体的活化 配体与载体的偶联配体与载体的偶联 亲和吸附剂的装柱亲和吸附剂的装柱3.猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制猪胰蛋白酶原的提取猪胰蛋白酶原的提取 胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活 上亲和层析柱纯化上亲和层析柱纯化三大任务三大任务!做明白人，干明白事。先动脑，再动手。做明白人，干明白事。先动脑，再动手。！实验无小事，事事不马虎。！实验无小事，事事不马虎。!实验结果和数据及时保存及处理实验结果和数据及时保存及处理!保持实验室整洁保持实验室整洁。N项注意项注意*胰蛋白酶标准品的比活力胰蛋白酶标准品的比活力胰蛋白酶标准品的比活力胰蛋白酶标准品的比活力（BAEEBAEE单位单位/mg/mg蛋白）蛋白）*鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力（BAEEBAEE单位单位/mg/mg蛋白）蛋白）*胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力（BAEEBAEE单位单位/mg/mg蛋白）蛋白）*.*.鸡卵类粘蛋白产率鸡卵类粘蛋白产率(mg/100ml):(mg/100ml):100ml100ml鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的mgmg数。数。数。数。*.*.偶联率偶联率(mg/g):(mg/g):1g Sepharose 4B 1g Sepharose 4B偶联鸡卵类粘蛋白的偶联鸡卵类粘蛋白的偶联鸡卵类粘蛋白的偶联鸡卵类粘蛋白的mgmg数。数。数。数。*.*.亲和吸附率亲和吸附率(mg/g):(mg/g):1g Sepharose 4B 1g Sepharose 4B结合胰蛋白酶的结合胰蛋白酶的结合胰蛋白酶的结合胰蛋白酶的mgmg数。数。数。数。*.*.活性回收率活性回收率:经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。*.*.纯化倍数纯化倍数:亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。需要得到的结果需要得到的结果*Sephadex*Sephadex G-25G-25柱柱层层析析鸡鸡卵卵类类粘粘蛋白脱盐的层析图蛋白脱盐的层析图*DE-32*DE-32纤维素离子交换柱层析分纤维素离子交换柱层析分离鸡卵类粘蛋白的层析图离鸡卵类粘蛋白的层析图*绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图操作步骤 用具清洗和试剂配制0.02mol/L,pH6.5 0.02mol/L,pH6.5 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(磷酸氢二钠磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液磷酸二氢钠缓冲液)注意：注意：是指是指NaNa2 2HPOHPO4 4和和NaHNaH2 2POPO4 4的总浓度。的总浓度。先配制先配制1010倍的母液（倍的母液（），用时稀释），用时稀释1010倍。倍。1 1、查附录中缓冲液配制表，确定查附录中缓冲液配制表，确定NaNa2 2HPOHPO4 4和和 NaHNaH2 2POPO4 4的比例；的比例；2 2、分别配制、分别配制的的NaNa2 2HPOHPO4 4和和NaHNaH2 2POPO4 4溶液；溶液；3 3、按比例混合、按比例混合2 2HPOHPO4 4溶液和溶液和2 2POPO4 4溶液，直至溶液，直至pHpH为为。pH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/mlpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/ml5.88.092.07.061.039.06.012.387.77.272.028.06.426.573.57.481.019.06.531.568.57.687.013.06.637.562.57.891.58.56.849.051.08.094.75.3磷酸氢二钠磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液磷酸二氢钠缓冲液（）（）（25）磷酸氢二钠：磷酸氢二钠：Na2HPO412H2O 71.64g/1,000ml磷酸二氢钠：磷酸二氢钠：NaH2PO42H2O 31.21g/1,000ml鸡卵类粘蛋白的制备 50毫升鸡蛋清毫升鸡蛋清+50毫升毫升10%三氯醋酸三氯醋酸的盐溶液，产生白的盐溶液，产生白色沉淀，色沉淀，pH应为。应为。室温静置室温静置4小时以上，小时以上，3000转转/分分 离心离心10分钟。上清液分钟。上清液用滤纸过滤。用滤纸过滤。pH为。为。缓慢加入缓慢加入3倍体积的预冷丙倍体积的预冷丙酮。在冰浴中静置酮。在冰浴中静置4小时。小时。2、Sephadex G-25凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐称取称取30克克Sephadex G-25，用，用磷酸缓冲液室温溶胀磷酸缓冲液室温溶胀24小时。小时。真真空空脱脱气气后后装装柱柱，用用磷磷酸酸缓缓冲冲液液平平衡衡柱柱床床，直直至至记记录录仪仪绘出稳定基线。绘出稳定基线。取取20毫毫升升鸡鸡卵卵类类粘粘蛋蛋白白粗粗提提液液上上柱柱脱脱盐盐（上上样样量量不不超超过过柱柱床床体体积的积的1/6），用磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。），用磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。1.鸡卵类粘蛋白的制备鸡卵类粘蛋白的制备3 3 3 3、鸡卵类粘蛋白粗品的精制、鸡卵类粘蛋白粗品的精制、鸡卵类粘蛋白粗品的精制、鸡卵类粘蛋白粗品的精制（离子交换纤维素层析）（离子交换纤维素层析）（离子交换纤维素层析）（离子交换纤维素层析）称取称取DE-32粉粉10克，用克，用150ml 溶液浸泡溶液浸泡20分钟，分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。用用150ml 溶液浸泡溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏水洗分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。至中性后，抽去水分。用用150ml 的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液浸泡浸泡10分钟，脱气装柱。分钟，脱气装柱。将将脱脱盐盐后后的的鸡鸡卵卵类类粘粘蛋蛋白白粗粗提提液液上上柱柱，以以的的磷磷酸缓冲液洗去杂蛋白。酸缓冲液洗去杂蛋白。用用磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗脱，收集第二峰。洗脱，收集第二峰。将经将经DE-32纯化的鸡卵类粘蛋白溶液装入纯化的鸡卵类粘蛋白溶液装入透析透析袋袋内，用蒸馏水内，用蒸馏水透析透析，直到用，直到用1%硝酸银硝酸银检查检查无氯离子为止。无氯离子为止。调调pH至至4.0,加加3倍体积的预冷丙酮，冰浴静置倍体积的预冷丙酮，冰浴静置4小小时以上，离心取沉淀，即得鸡卵类粘蛋白纯品。时以上，离心取沉淀，即得鸡卵类粘蛋白纯品。标准胰蛋白酶比活性的测定CHOM粗品/纯品抑制比活性的测定 CHOM纯品的要求：品质：比活力8,000BAEEunit/mgprotein数量：200mg亲和吸附剂的合成亲和吸附剂的合成 载体载体Sepharose 4B的活化的活化称取称取12克（湿重）克（湿重）Sepharose 4B 凝胶凝胶，用，用100ml 溶液淋洗，再用蒸溶液淋洗，再用蒸馏水洗去馏水洗去NaCl，抽干。，抽干。加加10ml 2mol/L NaOH,5ml环氧氯丙烷，环氧氯丙烷，5ml乙晴。室温下搅拌活乙晴。室温下搅拌活化化16-20小时。小时。用蒸馏水洗去未反应得残留试剂，再用用蒸馏水洗去未反应得残留试剂，再用3缓冲液缓冲液洗涤洗涤,处理好待用。处理好待用。一步都不能出错！不要忘记测定和计算！活化载体与鸡卵类粘蛋白（配体）的偶联活化载体与鸡卵类粘蛋白（配体）的偶联活化载体与鸡卵类粘蛋白（配体）的偶联活化载体与鸡卵类粘蛋白（配体）的偶联用用10毫毫升升3缓缓冲冲液液溶溶解解鸡鸡卵卵类类粘粘蛋蛋白白，加加入入到到活活化化好好得得Sepharose 4B凝胶中，室温下，搅拌凝胶中，室温下，搅拌20-24小时。小时。偶偶联联终终止止后后，抽抽滤滤。用用溶溶液液洗洗去去未未被被偶偶联联的的鸡鸡卵卵类类粘粘蛋蛋白白，再再用用蒸蒸馏水洗去馏水洗去NaCl。用甲酸的溶液洗，破坏残存的环氧基。再用蒸馏水洗至中性。用甲酸的溶液洗，破坏残存的环氧基。再用蒸馏水洗至中性。用用30毫升亲和柱平衡液浸泡毫升亲和柱平衡液浸泡10分钟，脱气装柱。分钟，脱气装柱。一步都不能出错！不要忘记测定和计算！猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶原的激活取胰脏取胰脏50克，加克，加150毫升预冷的毫升预冷的乙酸酸化水乙酸酸化水，用，用组织捣碎机组织捣碎机捣碎。捣碎。匀匀浆浆。在在5-10提提取取4小小时时以以上上。四四层层纱纱布布过过滤滤。滤滤液液用用2SO4调调。静置静置2-4小时，过滤收集滤液就是胰蛋白酶粗提液。小时，过滤收集滤液就是胰蛋白酶粗提液。酶酶原原粗粗提提液液用用NaOH调调节节pH8.0,加加入入固固体体CaCl2使使溶溶液液的的Ca+浓浓度度达达到。到。加加2mg结晶猪胰蛋白酶结晶猪胰蛋白酶，搅匀，于，搅匀，于4冰箱中激活冰箱中激活12-16小时。小时。待待酶酶比比活活力力达达到到800-1000BAEE/mg停停止止激激活活，用用2SO4调调，滤滤去去CaSO4沉淀物，备用。沉淀物，备用。不要忘记测定和计算！不要忘记测定和计算！亲和吸附剂装柱亲和吸附剂装柱上样上样洗脱洗脱亲和层析纯化胰蛋白酶不要忘记测定和计算！不要忘记测定和计算！价格表价格表 品名 价格Sepharose 4B 4100元元/1LDEAE-32 cellulose 2600元元/100gSephadex G-25 1800元元/100gAcetone 时间安排时间安排 讲授实验原理及操作讲授实验原理及操作 清洗用具、配制试剂（注意贴好标签）清洗用具、配制试剂（注意贴好标签）提取提取CHOM(做到丙酮沉淀做到丙酮沉淀CHOM，过夜），过夜）溶胀溶胀Sephadex G-25（干粉）（干粉）Sephadex G-25洗涤装柱（已溶胀）洗涤装柱（已溶胀）处理处理DEAE-32纤维素并装柱纤维素并装柱 测定标准胰蛋白酶活性测定标准胰蛋白酶活性第一天第一天理顺思路！要做什么？怎么做？理顺思路！要做什么？怎么做？第二天第二天离心收集离心收集CHOM Sephadex G-25装柱（溶胀装柱（溶胀24小时后）小时后）用用Sephadex G-25脱盐脱盐提取第二份和提取第二份和第三份第三份CHOM DEAE-32离子交换层析纯化离子交换层析纯化CHOM透析透析测定测定CHOM的抑制活力的抑制活力（要求：数量：（要求：数量：200mg 比活力比活力 8,000BAEE/mg）上课时间不得随意离开实验室！上课时间不得随意离开实验室！提取和激活胰蛋白酶原提取和激活胰蛋白酶原 处理并活化处理并活化Sepharose 4B 继续继续第二天第二天的工作的工作第三天第三天值日生负责当天实验室的卫生和安全值日生负责当天实验室的卫生和安全 CHOMCHOM与与Sepharose 4BSepharose 4B偶联偶联 提取和激活胰蛋白酶原（第二份）提取和激活胰蛋白酶原（第二份）整理实验数据，准备整理实验数据，准备pptppt 继续继续第二天第二天和和第三天第三天的工作的工作第四天第四天做好实验的同时，做好实验的同时，承担的公务不要忘记！承担的公务不要忘记！测定胰蛋白酶粗提液活性测定胰蛋白酶粗提液活性亲和层析纯化胰蛋白酶亲和层析纯化胰蛋白酶测定亲和层析纯化后的胰蛋白酶比活性测定亲和层析纯化后的胰蛋白酶比活性继续继续第三天第三天和和第四天第四天的工作的工作继续整理实验数据，完成继续整理实验数据，完成ppt制作制作第五天第五天态度决定一切！注意实验细节！态度决定一切！注意实验细节！完成所有的工作完成所有的工作打扫实验室打扫实验室第六天上午第六天上午结果展示v鸡卵粘蛋白产率（平均值):232.6mg/100ml鸡蛋清v偶联率：10mg/mlSepharose4Bv抑制率：94.6%v亲和吸附率：1.48mg/mlSepharose4B(?)v纯化倍数：实验课表现50分出勤：出勤：出勤：出勤：1212分分分分操作：操作：操作：操作：1818分分分分 结果：结果：结果：结果：4 4分分分分 总结：总结：总结：总结：4 4分分分分协作：协作：协作：协作：4 4分分分分 公务：公务：公务：公务：3 3分分分分卫生：卫生：卫生：卫生：5 5分分分分标题（中英文对照）标题（中英文对照）摘要和关键词（中英文对照）摘要和关键词（中英文对照）文献综述文献综述研究目的研究目的材料与方法材料与方法结果与分析结果与分析讨论讨论参考文献参考文献致谢致谢课程论文英文写作加英文写作加2分分学位论文形式学位论文形式A4规格打印稿规格打印稿后记后记实验报告每人一份，独立完成！坚决打击盗版！如发现盗版，正版和盗版同样对待！