蛋白质分离技术-层析.ppt

亲亲 和和 层层 析析Affinity Chromatography（AC）一、原理一、原理n n生生物物分分子子间间存存在在很很多多特特异异性性的的相相互互作作用用，它它们们之之间间都都能能够够专专一一而而可可逆逆的的结结合合，这这种结合力就称为亲和力。种结合力就称为亲和力。n n亲亲和和层层析析亲亲和和层层析析就就是是通通过过将将具具有有亲亲和和力力的的两两个个分分子子中中一一个个固固定定在在不不溶溶性性基基质质上上，利利用用分分子子间间亲亲和和力力的的特特异异性性和和可可逆逆性，对另一个分子进行分离纯化。性，对另一个分子进行分离纯化。酶：酶：酶：酶：基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗体：抗体：抗体：抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞DNADNADNADNA：互补互补互补互补DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA，组蛋白，核酸聚合酶，组蛋白，核酸聚合酶，组蛋白，核酸聚合酶，组蛋白，核酸聚合酶，结合结合结合结合 蛋白蛋白蛋白蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白细胞：细胞：细胞：细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素凝集素：凝集素：凝集素：凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞常见具有专一性亲和力的生物常见具有专一性亲和力的生物分子对分子对：Some definitions in affinity chromatographyn nMatrix(Matrix(基质或载体基质或载体):an inert gel to which a ligand can be coupled:an inert gel to which a ligand can be coupledn nLigandLigand（配基）（配基）:a component which interacts specifically with:a component which interacts specifically with the targetthe targetn nCouplingCoupling（偶联）（偶联）:covalent attachment of the ligand to the:covalent attachment of the ligand to the matrixmatrixn nBindingBinding（结合）（结合）:association between the ligand and the target:association between the ligand and the targetn n固相化固相化固相化固相化 (ImmobiliseImmobilise)MatrixSpecific ligand样品样品样品样品固相化 再生固相化固相化将配体以共价键连接于载体上将配体以共价键连接于载体上制成亲和吸附剂制成亲和吸附剂n n载体的排斥效应载体的排斥效应载体的排斥效应载体的排斥效应小孔经凝胶会明显阻小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基止大分子物与配基结合结合n n载体的空间障碍载体的空间障碍载体的空间障碍载体的空间障碍载体影响了配基的空载体影响了配基的空间，特别是小分子间，特别是小分子配基。需加碳氢链配基。需加碳氢链“手臂手臂”，长度需，长度需适中适中。二、二、亲和层析分离过程亲和层析分离过程1 1 1 1、装柱和平衡、装柱和平衡、装柱和平衡、装柱和平衡2 2 2 2、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附3 3 3 3、洗脱、洗脱、洗脱、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附n n影响吸附的因素 1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。2、流速尽可能慢，电电荷高者荷高者离子离子大者大者浓度浓度大者大者阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂n n电价数：电价数：电价数：电价数：NaNaNaNa+CaCaCaCa+AlAlAlAl+TiTiTiTi+n n原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数 Li Li Li Li+NaNaNaNa+KKKK+PbPbPbPb+阴离子阴离子阴离子阴离子n n强碱性交换树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂CHCHCHCH3 3 3 3COOCOOCOOCOO-FFFF-OHOHOHOH-HCOOHCOOHCOOHCOO-CLCLCLCL-SCNSCNSCNSCN-BrBrBrBr-CrOCrOCrOCrO4 4 4 4=NONONONO3 3 3 3-IIII-CCCC2 2 2 2OOOO4 4 4 4=SOSOSOSO4 4 4 4=n n弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂F F F F-CL CL CL CL-Br Br Br Br-=I=I=I=I-=CH=CH=CH=CH3 3 3 3COOMoCOOMoCOOMoCOOMo4 4 4 4=POPOPOPO4 4 4 4=NONONONO3 3 3 3-酒酒酒酒石酸根石酸根石酸根石酸根柠檬酸根柠檬酸根柠檬酸根柠檬酸根CCCC2 2 2 2OOOO4 4 4 4=SOSOSOSO4 4 4 4=OHOHOHOH操作过程：操作过程：1.1.装柱；装柱；2.2.离子交换；离子交换；3.3.洗脱洗脱三、离子交换剂与缓三、离子交换剂与缓冲液的选择冲液的选择（一）离子交换剂的选择一）离子交换剂的选择必须考虑的影响因素必须考虑的影响因素 1阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择2强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择3不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择4不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择n n测定测定pIpIn n确定稳定确定稳定pHpH范围范围 碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c c c c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCGHCGHCGHCG离子交换剂的选择图离子交换剂的选择图不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择1.1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素1 1、缓冲液缓冲液pHpH的选择的选择 2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 要求：要求：要求：要求：起起起起始始始始缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液能能能能使使使使样样样样品品品品中中中中有有有有效效效效成成成成分分分分与与与与离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂结结结结合合合合，洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液能能能能使使使使有有有有效效效效成成成成分分分分从从从从离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂上解离下来。上解离下来。上解离下来。上解离下来。PH PH PH PH值与目标物值与目标物值与目标物值与目标物pIpIpIpI的关系（的关系（的关系（的关系（pH=pI1pH=pI1pH=pI1pH=pI1）选用弱阳离子交换剂时，选用弱阳离子交换剂时，选用弱阳离子交换剂时，选用弱阳离子交换剂时，pHpHpHpH高于其高于其高于其高于其pKpKpKpK；选用弱阴离子交换剂时，选用弱阴离子交换剂时，选用弱阴离子交换剂时，选用弱阴离子交换剂时，pHpHpHpH低于其低于其低于其低于其pKpKpKpK；2 2、缓冲液离子组成的选择缓冲液离子组成的选择采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：如：TrisTris缓缓冲冲液液离离子子不不影影响响被被分分离离物物的的活活性性、测测定定、溶解度。溶解度。3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择起起起起始始始始缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液能能能能使使使使样样样样品品品品中中中中有有有有效效效效成成成成分分分分与与与与离离离离子子子子交交交交换换换换剂结合，一般小于。剂结合，一般小于。剂结合，一般小于。剂结合，一般小于。洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液能能能能使使使使有有有有效效效效成成成成分分分分从从从从离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上解解解解离离离离下下下下来，一般（或采用来，一般（或采用来，一般（或采用来，一般（或采用pHpHpHpH洗脱）。洗脱）。洗脱）。洗脱）。原则原则：所所用用洗洗脱脱液液比比吸吸着着物物质质具具有有更更活活泼泼的的离离子或基团子或基团 改变改变pHpH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱(三三)洗脱剂洗脱剂四、应用四、应用适用于适用于 分分离离多多肽肽蛋蛋白白、氨氨基基酸酸、核核酸酸及及其其他带电的生物分子。他带电的生物分子。五、离子交换层析的五、离子交换层析的优点优点n n应用范围广：20种氨基酸中，大部分带正电或负电。n n处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。n n去除杂质能力强，如对核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及电荷性有差别的蛋白均可去除。n n分离能力强。n n可放在纯化工艺的任何一步。Hydrophobicinteractionchromatography（HIC）疏疏水水层层析析亦亦称称疏疏水水作作用用层层析析(hydrophobic hydrophobic interaction interaction chromatographychromatography，HIC)HIC)，从从分分离离纯纯化化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类 是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法的柱层析方法。一、疏水层析的原理一、疏水层析的原理 不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。（一）疏水作用（一）疏水作用蛋白质与固定相结合原理蛋白质与固定相结合原理蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面子内部的疏水残基暴露至分子表面疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合面的疏水残基容易与疏水性固定相结合洗脱原理洗脱原理 通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱）渐洗脱）（二）吸附剂（二）吸附剂根据基质的性质不同分为：根据基质的性质不同分为：1.1.亲水性吸附剂：亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（糖（SepharoseSepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成耦合而成特点：特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统不耐压，一般仅用于常压层析系统2.2.非亲水性吸附剂：非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合价键结合特点：特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如特别适用于高压层析（如HPLCHPLC等）等）二、操作二、操作1.1.制备层析柱制备层析柱2.2.加样与洗脱加样与洗脱3.3.层析柱再生层析柱再生57Equilibration1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionEquilibrate the column and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater molecules58Sample application1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionGel matrixProteinsHydrophobic groups 59Washing out unbound material1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-bound proteins60Elution1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionTarget elutesConc.saltAbs61ElutionConc.saltAbs1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.ElutionMore strongly bound proteins样品的准备：样品的准备：n n往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的pHpHpHpH使其满足吸附条件使其满足吸附条件使其满足吸附条件使其满足吸附条件 。n nHICHICHICHIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样样样样 洗脱的方式：洗脱的方式：n n采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；n n通过往流动相中添加有机溶剂通过往流动相中添加有机溶剂通过往流动相中添加有机溶剂通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇、，如：乙二醇、丙醇、，如：乙二醇、丙醇、，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶剂中稳（溶剂中稳（溶剂中稳（溶剂中稳定性良好的物质）定性良好的物质）定性良好的物质）定性良好的物质）n n往流动相中添加去污剂等往流动相中添加去污剂等往流动相中添加去污剂等往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发，去污剂本身能与介质发，去污剂本身能与介质发，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）来（分离膜蛋白）来（分离膜蛋白）来（分离膜蛋白）洗脱理论：洗脱理论：n n疏溶剂理论：疏溶剂理论：疏溶剂理论：疏溶剂理论：1976197619761976年由年由年由年由SinanogluSinanogluSinanogluSinanoglu等人提出，认为由等人提出，认为由等人提出，认为由等人提出，认为由于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，而增加了与疏水配基结合的概率。而增加了与疏水配基结合的概率。而增加了与疏水配基结合的概率。而增加了与疏水配基结合的概率。n n自由能分离理论：自由能分离理论：自由能分离理论：自由能分离理论：1979197919791979年年年年VanossVanossVanossVanoss等人提出，认为生等人提出，认为生等人提出，认为生等人提出，认为生物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这个引力随溶液盐析能力的改变而改变。个引力随溶液盐析能力的改变而改变。个引力随溶液盐析能力的改变而改变。个引力随溶液盐析能力的改变而改变。n n熵分离理论：熵分离理论：熵分离理论：熵分离理论：1984198419841984年年年年RegnierRegnierRegnierRegnier提出，认为高盐溶液中，提出，认为高盐溶液中，提出，认为高盐溶液中，提出，认为高盐溶液中，蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥开，使体系熵增加。水分子被排斥开，使体系熵增加。水分子被排斥开，使体系熵增加。水分子被排斥开，使体系熵增加。三三 介质的选择介质的选择n n基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的半刚性的半刚性的半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质质质质；n n近年来研制近年来研制近年来研制近年来研制超大琼脂糖超大琼脂糖超大琼脂糖超大琼脂糖(superporous)(superporous)(superporous)(superporous)，在扩散孔，在扩散孔，在扩散孔，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率；较好的分辨率；较好的分辨率；较好的分辨率；n n壳聚糖壳聚糖壳聚糖壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近具有良好的生物相容性和化学稳定性，近具有良好的生物相容性和化学稳定性，近具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用。年来在疏水层析中也得到了应用。年来在疏水层析中也得到了应用。年来在疏水层析中也得到了应用。层析介质的再生、贮存层析介质的再生、贮存 ：n n再生：常规用再生：常规用再生：常规用再生：常规用蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物清洗，如有疏水性很强的物清洗，如有疏水性很强的物清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗，合适的清洗剂进行清洗，合适的清洗剂进行清洗，合适的清洗剂进行清洗，NaOHNaOHNaOHNaOH溶液是其中常用溶液是其中常用溶液是其中常用溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化失活起到生物钝化失活起到生物钝化失活起到生物钝化失活起到消毒的效果消毒的效果消毒的效果消毒的效果。此外，。此外，。此外，。此外，促溶盐类促溶盐类促溶盐类促溶盐类的水溶液的水溶液的水溶液的水溶液也是良好的清洗剂。也是良好的清洗剂。也是良好的清洗剂。也是良好的清洗剂。n n贮存：一般悬浮在贮存：一般悬浮在贮存：一般悬浮在贮存：一般悬浮在20%20%20%20%的乙醇中，如在水溶液体的乙醇中，如在水溶液体的乙醇中，如在水溶液体的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物的生长。生物的生长。生物的生长。生物的生长。HICHICHICHIC介质的疏水配基主要为介质的疏水配基主要为介质的疏水配基主要为介质的疏水配基主要为烷基和芳香基烷基和芳香基烷基和芳香基烷基和芳香基，其，其，其，其烷基通常在烷基通常在烷基通常在烷基通常在C8C8C8C8以下，芳香基多为苯基。以下，芳香基多为苯基。以下，芳香基多为苯基。以下，芳香基多为苯基。四四 配基的选择配基的选择偶联至基质的偶联至基质的常见配基类型常见配基类型（A A）丁基，）丁基，（B B）辛基，）辛基，（C C）苯基，）苯基，（D D）新戊基）新戊基 对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具具中等疏水的高分子配基中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚如聚乙二醇和聚丙二醇等丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。免了上述缺点。常用商品化疏水层析介质常用商品化疏水层析介质 Octyl Sepharose 4 Fast Flow Octyl Sepharose 4 Fast Flow Octyl Sepharose 4 Fast Flow Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作工作工作工作pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为3-13,3-13,3-13,3-13,清洗清洗清洗清洗pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为2-14,2-14,2-14,2-14,工作的最大速工作的最大速工作的最大速工作的最大速度是度是度是度是600cm/h,600cm/h,600cm/h,600cm/h,配基结合量为每配基结合量为每配基结合量为每配基结合量为每ml50molml50molml50molml50mol正辛烷基正辛烷基正辛烷基正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。Butyl Sepharose 4 Fast Flow Butyl Sepharose 4 Fast Flow Butyl Sepharose 4 Fast Flow Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作工作工作工作pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为3-133-133-133-13，清洗，清洗，清洗，清洗pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为2-142-142-142-14，工作的最大，工作的最大，工作的最大，工作的最大速度是速度是速度是速度是600cm/h,600cm/h,600cm/h,600cm/h,配基结合量为每配基结合量为每配基结合量为每配基结合量为每ml 50mol ml 50mol ml 50mol ml 50mol 正丁烷基正丁烷基正丁烷基正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。Phenyl Sepharose 6 Fast Flow Phenyl Sepharose 6 Fast Flow Phenyl Sepharose 6 Fast Flow Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水性强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子疏水性强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子疏水性强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子疏水性强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理的预处理的预处理的预处理，配基结合量为每，配基结合量为每，配基结合量为每，配基结合量为每ml40molml40molml40molml40mol，苯基苯基苯基苯基PhenylPhenylPhenylPhenyl，工作，工作，工作，工作pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为3-133-133-133-13，清洗，清洗，清洗，清洗pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为2-142-142-142-14，工作的最大速度是工作的最大速度是工作的最大速度是工作的最大速度是600cm/h 600cm/h 600cm/h 600cm/h。Phenyl Sepharose CL-4B Phenyl Sepharose CL-4B Phenyl Sepharose CL-4B Phenyl Sepharose CL-4B 疏水性较疏水性较疏水性较疏水性较正辛烷基正辛烷基正辛烷基正辛烷基弱，弱，弱，弱，适用于分离和纯化对疏水性适用于分离和纯化对疏水性适用于分离和纯化对疏水性适用于分离和纯化对疏水性尚未了解的蛋白尚未了解的蛋白尚未了解的蛋白尚未了解的蛋白，配基结合量为每，配基结合量为每，配基结合量为每，配基结合量为每ml40molml40molml40molml40mol苯基苯基苯基苯基PhenylPhenylPhenylPhenyl；工作；工作；工作；工作pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为3-133-133-133-13，清洗，清洗，清洗，清洗pHpHpHpH范围为范围为范围为范围为2-142-142-142-14，工作的工作的工作的工作的最大速度是最大速度是最大速度是最大速度是50cm/h50cm/h50cm/h50cm/h 。五五 疏水层析的影响因素疏水层析的影响因素1 1、盐类和盐组成盐类和盐组成n n流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。吸附能力具有最为重大的影响。吸附能力具有最为重大的影响。吸附能力具有最为重大的影响。n n选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。白质的活性都很重要。白质的活性都很重要。白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠硫酸铵、醋酸铵、氯化钠硫酸铵、醋酸铵、氯化钠硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。n n2 2、离子强度离子强度 离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留保留保留保留值值值值。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分的解析附能力。离子强度来提高组分的解析附能力。离子强度来提高组分的解析附能力。离子强度来提高组分的解析附能力。HIC HIC HIC HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。n n3 3、溶液的酸碱度溶液的酸碱度 溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH值主要考虑能维持生物大分子生物活性值主要考虑能维持生物大分子生物活性值主要考虑能维持生物大分子生物活性值主要考虑能维持生物大分子生物活性的的的的pHpHpHpH环境。一般情况，溶液的环境。一般情况，溶液的环境。一般情况，溶液的环境。一般情况，溶液的pHpHpHpH接近蛋白质的等接近蛋白质的等接近蛋白质的等接近蛋白质的等电点电点电点电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；用；用；用；远离其等电点远离其等电点远离其等电点远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定，其疏水性减少，不利于与固定，其疏水性减少，不利于与固定，其疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH也可以改变蛋白质的疏水性。也可以改变蛋白质的疏水性。也可以改变蛋白质的疏水性。也可以改变蛋白质的疏水性。n n4 4、柱温柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏疏疏疏水作用增加水作用增加水作用增加水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的，吸附能力增加，有利于提高层析柱的，吸附能力增加，有利于提高层析柱的，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。低温下操作。低温下操作。低温下操作。六、疏水层析的六、疏水层析的优点优点1、原则上可用于所有蛋白质纯化，处理量大，特别是从大体积样品中提取低含量的目标蛋白显优势2、对DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率较高，尤其是对细胞DNA一步去除率可达90以上3、一般放在纯化工艺的最前面。4、条件温和，不易使蛋白变性。5、可用于蛋白的浓缩。6、在纯化方案中，疏水作用层析可以用于样品的捕获、中度纯化、精细纯化。各种层析的效果对比各种层析的效果对比：nIEC 离子交换层析nAC 亲和层析作业：作业：绘制某一蛋白的纯化流程图绘制某一蛋白的纯化流程图要求：要求：1、注明每一步的纯化条件和纯化、注明每一步的纯化条件和纯化方法。方法。2、必须包括粗分级分离和细分级、必须包括粗分级分离和细分级分离（层析）两个步骤。分离（层析）两个步骤。3、A4纸双面打印纸双面打印