生物化学生物信息的传递上-从DNA到RNA.ppt

第三章第三章 生物信息的传递（上）生物信息的传递（上）从从DNADNA到到RNARNA3.1 RNA3.1 RNA的转录的转录3.2 3.2 启动子与转录起始启动子与转录起始3.3 3.3 原核生物与真核生物原核生物与真核生物mRNAmRNA的特征比较的特征比较3.4 3.4 终止与抗终止终止与抗终止3.5 3.5 内含子的剪接、编辑及化学修饰内含子的剪接、编辑及化学修饰DNA序列是序列是遗遗传信息的贮存传信息的贮存者，者，它通过自它通过自主复制得到永主复制得到永存，并通过存，并通过转转录录生成信使生成信使RNA、翻译翻译生生成蛋白质的过成蛋白质的过程来控制生命程来控制生命现象。现象。转录转录(transcription)基因表达基因表达翻译翻译(translation)拷贝出一条与拷贝出一条与DNA链序列完全相同链序列完全相同(U替换替换T)的的RNA单链单链的过程，是基因表的过程，是基因表达的核心步骤；达的核心步骤；以新生的以新生的mRNA为模为模板，把核苷酸三联遗板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的过程，是基因表达的最终目的。的最终目的。DNARNAProtein转转 录录翻翻 译译ATGCRNARNA分子分子来自来自DNADNA。储存于储存于DNADNA双链中双链中的遗传信息通过转的遗传信息通过转录酶促反应按照录酶促反应按照碱碱基互补配对基互补配对的原则的原则被转化成为被转化成为单链单链RNARNA分子分子。生物体内共有生物体内共有3 3种种信使信使RNA(messenger RNA，mRNA)转移转移RNA(transfer RNA，tRNA)核糖体核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)转录转录(transcription):是指以是指以DNA为模板，在依赖于为模板，在依赖于DNA的的 RNA聚和酶催化下，以聚和酶催化下，以4中中rNTP（ATP、CTP、GTP和和UTP）为原料，合成）为原料，合成RNA 的过程。的过程。转录转录 (transcriptiontranscription )生物体以生物体以DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA的过程的过程转转录录RNADNA 在有些病毒中，在有些病毒中，RNARNA也可以指导合成也可以指导合成RNARNA。t 是基因表达的第一步，也是最关键的一步。是基因表达的第一步，也是最关键的一步。t 以以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板中的一条单链作为转录模板 (杂交实验所证实杂交实验所证实)T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶有意义链有意义链反意义链反意义链RNAPPi555533GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成333355转转 录录 过过 程程 有义链有义链 (sense strand)又称编码链又称编码链 coding strand:指不作模板的指不作模板的DNA单链单链 反义链反义链 (antisense strand)又称模板链又称模板链 template srand:指作为模板进行指作为模板进行RNA转录的链转录的链 (60年代以前的表示方法与此相反年代以前的表示方法与此相反)没有没有 AU GC 的规律的规律t 在依赖在依赖DNA的的RNA聚合酶作用下进行转录聚合酶作用下进行转录t AU、CG 合成合成RNA分子分子t 转录合成转录合成RNA链的方向为链的方向为53，模板单链模板单链DNA的极性的极性 方向为方向为35，而非模板单链的极性方向与而非模板单链的极性方向与RNA链相链相 同，均为同，均为53。（书写）。（书写）t 基因转录方式为不对称转录基因转录方式为不对称转录(一条单链一条单链DNA 为模板为模板,RNA 聚合酶的结合聚合酶的结合)参参 与与 转转 录录 的的 物物 质：质：原料原料:4 4种种NTPNTP (A ATP,U UTP,G GTP,C CTP)模板模板:DNADNA酶酶 :RNARNA聚合酶聚合酶其他蛋白质因子其他蛋白质因子不对称转录不对称转录 两层含义：两层含义：（1）在）在DNA双链分子上，仅一股链可转录双链分子上，仅一股链可转录 （2）模板链非永远在同一条单链上）模板链非永远在同一条单链上模模 板板为结构基因为结构基因（有义链、编码连）（有义链、编码连）为反义链（模板链）为反义链（模板链）不对称转录不对称转录3355（箭头表示转录产物生成方向）（箭头表示转录产物生成方向）3.1 RNA的转录的转录3.1.1 转录的基本过程转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括本过程都包括:模板识别模板识别、转录起始转录起始、通过通过启动子启动子及及转录的延伸和终止转录的延伸和终止。RNA 的转录包括的转录包括 promotion.elongation.terminaton 三过程三过程 t 从启动子从启动子(promoter)到终止子到终止子(terminator)称为转录单称为转录单 位位(transcription unit)(转录起始点转录起始点)t 原核生物的转录单位多为原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真真 核生物中的核生物中的 转录单位多为转录单位多为monocistron,No operon t 转录起点即转录原点记为转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值，下游，其上游记为负值，下游 记为正值记为正值 upstream start point downstream10110转录起始点两个相关概念两个相关概念:操纵元操纵元(operon):是原核生物基因是原核生物基因 表达调控的一个表达调控的一个 完整单元，其中完整单元，其中 包括结构基因、包括结构基因、调节基因、操纵调节基因、操纵 子和启动子子和启动子ipozyaNo lac mRNAAbsence of lactoseActiveipozya-Galactosidase Permease TransacetylasePresence of lactose Inactive酶与模板的辩认结合酶与模板的辩认结合 1、转录起始点、转录起始点开始转录的位点，常标以开始转录的位点，常标以+1 2、结合部位、结合部位约为约为7个碱基长度，其中心位于上个碱基长度，其中心位于上 游游-10 bp处被称为处被称为 10区区或或 Pribnow 盒盒(TATA盒）。该盒）。该 区具高度保守性，并易解链。区具高度保守性，并易解链。3、识别部位、识别部位RNA聚合酶聚合酶 亚基识别的部位，亚基识别的部位，约约 含含6个碱基长度，其中心位于上游个碱基长度，其中心位于上游-35 bp处被称为处被称为 35 区区。启启动动序序列列(原原核核）启动子（真核）启动子（真核）顺式作用元件顺式作用元件TGTTGACATATAAT3553DNA编码链编码链模板链模板链-35 区区-10 区区+15 McGPPP转录起始部位转录起始部位启动子启动子基因转录区基因转录区RNA产物产物NH2翻译开始翻译开始转录开始转录开始基本过程基本过程 1、转录起始、转录起始 原核生物原核生物需要依赖需要依赖 因子辨认转录起始点，因子辨认转录起始点，被辨认的被辨认的DNA区段处区段处-35区特定序列。区特定序列。真核生物真核生物转录起始也需要转录起始也需要RNApol对起始区对起始区上游上游DNA序列做辨认和结合，并生成起始复合物，序列做辨认和结合，并生成起始复合物，但其上游但其上游DNA序列（统称为顺式作用元件）不象序列（统称为顺式作用元件）不象原核生物那样典型。原核生物那样典型。2、延长、延长 在在RNA聚合酶催化下，按聚合酶催化下，按 53 方向合成方向合成 5，3-磷酸二酯键。酶磷酸二酯键。酶-DNA-RNA形成形成转录复合物。转录复合物。3、终止、终止 原核生物有两种机制：原核生物有两种机制：（1）依赖）依赖 因子（因子（Rho factor）的转录终止的转录终止可识别可识别来自来自RNA产物的终止信号，而不是来自产物的终止信号，而不是来自DNA摸板。摸板。（2）非依赖）非依赖 因子因子的转录终止的转录终止终止子特点是终止子特点是RNA产物具有发夹结构（茎产物具有发夹结构（茎-环结构）和一段富含环结构）和一段富含polyU片段。片段。真核生物的转录终止是与转录后修饰密切相关的：真核生物的转录终止是与转录后修饰密切相关的：启动子启动子(promoter)指指DNADNA分子上被分子上被RNARNA聚合酶识别并结合形成起始聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域转录复合物的区域 ，它还包括一些调节蛋白，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点因子的结合位点(频率、效率频率、效率)模板识别阶段模板识别阶段主要主要指指RNARNA聚合酶与启聚合酶与启动子动子DNADNA双链相互双链相互作用并与之相结合作用并与之相结合的过程。的过程。转录起始前，启动子附近转录起始前，启动子附近的的DNADNA双键分开形成转录泡双键分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与以促使底物核糖核苷酸与模板模板DNADNA的碱基配对。转录的碱基配对。转录起始就是起始就是RNARNA链上第一个核链上第一个核苷酸键的产生。苷酸键的产生。在原核生物中在原核生物中通过启动子阶段通过启动子阶段转录起始后直到形转录起始后直到形成成9个核苷酸短链个核苷酸短链此时此时RNARNA聚合酶一直处于聚合酶一直处于启动子区，新生的启动子区，新生的RNARNA链链与与DNADNA模板链的结合不够模板链的结合不够牢固，很容易从牢固，很容易从DNADNA链上链上掉下来并导致转录重新掉下来并导致转录重新开始。一旦开始。一旦RNARNA聚合酶成聚合酶成功地合成功地合成9 9个以上核苷酸个以上核苷酸并离开启动子区，转录并离开启动子区，转录就进人正常的就进人正常的延伸延伸阶段。阶段。所以，通过启动子的时间所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。代表一个启动子的强弱。一般说来，通过启动子的一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起时间越短，该基因转录起始的频率也越高。始的频率也越高。转录的延伸转录的延伸RNARNA聚合酶离开启动子，沿聚合酶离开启动子，沿DNADNA链移动并使新生链移动并使新生RNARNA链不链不断伸长的过程断伸长的过程在在3737时，大肠杆菌时，大肠杆菌RNARNA聚合酶完成该反应的速度为聚合酶完成该反应的速度为每秒每秒4040个核苷酸。个核苷酸。RNA聚合酶聚合酶的移动的移动新的单链新的单链DNA模板模板新生新生RNA链的链的3末端末端不断延伸不断延伸解链区形解链区形成成RNA-DNA杂合杂合物物双螺旋重双螺旋重新合成新合成RNA链的延伸图解链的延伸图解35RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶的移动方向聚合酶的移动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链（反义链）模板链（反义链）延长部位延长部位转录的终止转录的终止当当RNARNA链延伸到转录终止位点时，链延伸到转录终止位点时，RNARNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，键，RNA-DNARNA-DNA杂合物分离，转录泡杂合物分离，转录泡瓦解，瓦解，DNADNA恢复成双链状态，而恢复成双链状态，而RNARNA聚合酶和聚合酶和RNARNA链都被从模板上释放链都被从模板上释放出来出来 复复 制制 转转 录录模板模板 两股链两股链 模板链（反义链）模板链（反义链）原料原料 dNTP NTP配对配对 A-T,G-C A-U,G-C 聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 RNA聚合酶聚合酶产物产物 半保留半保留DNA 三种三种RNA 转录与复制的区别转录与复制的区别 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶不能直接识别基因的启动子区，不能直接识别基因的启动子区，需要需要转录调控因子转录调控因子(辅助蛋白质辅助蛋白质)按特定顺序结合于启动子上，按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物。聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物。转录和翻译的速度基本相等，转录和翻译的速度基本相等，37时，转录生成时，转录生成mRNA的速度每秒钟合成的速度每秒钟合成14个密码子，而蛋白质合成的速度大个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟约是每秒钟15个氨基酸。个氨基酸。3.1.2 转录机器的主要成分转录机器的主要成分3.1.2.1 RNA聚合酶聚合酶原核和真核生物的原核和真核生物的RNARNA在分子组成、种类和生化特性上各有特色。在分子组成、种类和生化特性上各有特色。不需要任不需要任何引物何引物RNARNA或或RNA-DNARNA-DNA双链杂合体不能作为模板双链杂合体不能作为模板双链双链DNADNA为模板为模板4 4种核苷三磷酸作为活性前体种核苷三磷酸作为活性前体Mg2Mg2/Mn2/Mn2为辅助因子为辅助因子一、原核生物的一、原核生物的RNA polymerase (E.coli)1、全酶、全酶(Holo Enzyme)和核心酶和核心酶(Core Enzyme)Core Enzyme Holo Enzyme 原核生物的原核生物的RNA聚合酶聚合酶(DDRP)E.coliE.coli的的RNARNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2 2 ）起始因子 RNA聚合酶全酶及核心酶电泳图谱聚合酶全酶及核心酶电泳图谱 (1)全酶（全酶（Holo Enzyme）用于转录的起始用于转录的起始 依靠空间结构与依靠空间结构与DNA模板结合模板结合(与核心与核心酶结合后合后 引起的构象引起的构象变化化)专一性地与一性地与DNA序列序列(启启动子子)结合合 结合常数：合常数：1014mol 半衰期：数小半衰期：数小时（107mol 1秒以下）秒以下）转录效率低，速度效率低，速度缓慢（慢（的结合的结合）（2）核心酶核心酶 （Core Enzyme）作用于转录的延伸过程（终止）作用于转录的延伸过程（终止）依靠静电引力依靠静电引力与与DNA模板结合模板结合（蛋白质中碱性（蛋白质中碱性 基团与基团与DNA的磷酸根之的磷酸根之 间）间）非专一性的结合（与非专一性的结合（与DNA的序列无关）的序列无关）结合常数：结合常数：1011mol 半衰期：半衰期：60秒秒 此外，新发现的一种此外，新发现的一种亚亚基的功能尚不清楚。基的功能尚不清楚。2、各、各亚亚基的特点和功能基的特点和功能 （1）因子因子 因子可重复使用因子可重复使用 修饰修饰RNApolRNApol构型构型 使使Holo Enzyme Holo Enzyme 识别启动子的识别启动子的Sextama Box(Sextama Box(3535区区),),并通过并通过与模板链结合与模板链结合2 2 2 2（3）全酶的组装过程）全酶的组装过程 不同的不同的因子识别不同的启动子因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种中有四种因子（因子（70、32、54、28）枯草杆菌中有枯草杆菌中有11种种因子因子 （因子的更替对转录起始的调控）因子的更替对转录起始的调控）（2）因子因子 核心酶的组建因子核心酶的组建因子 促使促使RNApol 与与DNA模板链结合模板链结合 2 2 前端前端因子使模板因子使模板DNA双链解链为单链双链解链为单链 尾端尾端因子使解链的单链因子使解链的单链DNA重新聚合为双链重新聚合为双链 （3）因子因子 促进促进RNApolNTP RNA elongation 完成完成NMP之间的磷酸酯键的连接之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）功能（排斥与模板链不互补的碱基）与与Rho（）因子竞争）因子竞争RNA 3end E site（elongation site RifR）:对对NTP非专一性地结非专一性地结 合（催化作用和合（催化作用和Editing功能）功能）（4）因子因子 参与参与RNA非模板链（非模板链（sense strand）的结合）的结合 （充当（充当SSB）构成构成Holoenzyme 后，后，因子含有两个位点因子含有两个位点 I site（initiation site.Rifs）:该位点专一性地结合该位点专一性地结合 ATP或者或者GTP （需要高浓度的（需要高浓度的ATP或或GTP）由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点 有义有义DNA链结合位点（链结合位点（亚基提供）亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（杂交链结合位点（亚基提供亚基提供）双链双链DNA解链位点（前端解链位点（前端 亚基提供亚基提供）单链单链DNA重旋位点（后端重旋位点（后端亚基提供亚基提供）因子作用位点因子作用位点E.coli RNA polymerase用于起始和延伸用于起始和延伸只用于起始只用于起始36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD每个细胞中约有每个细胞中约有70007000个个RNARNA聚合酶分子聚合酶分子每一时刻有每一时刻有2000500020005000个酶在执行转录个酶在执行转录DNADNA模板的功能模板的功能因子大大增加聚合酶对启动子的亲和力，并因子大大增加聚合酶对启动子的亲和力，并降低酶对非专一位点的亲和力，使酶专一性识降低酶对非专一位点的亲和力，使酶专一性识别模板上的启动子别模板上的启动子转录的起始从化学过程来转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启看是单个核苷酸与开链启动子酶复合物相结合构动子酶复合物相结合构成新生成新生RNARNA的的55端，再以端，再以磷酸二酯键的形式与第二磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合个核苷酸相结合起始的终止反映在起始的终止反映在因子的释放因子的释放当新生当新生RNARNA链达到链达到6 69 9个核苷酸时，能形成稳定的酶个核苷酸时，能形成稳定的酶DNADNARNARNA三元复合物，并释放三元复合物，并释放因子，转录进人延伸期因子，转录进人延伸期当聚合酶按当聚合酶按5 3方向延伸方向延伸RNA链时，解旋的链时，解旋的DNA区域也随之移动。区域也随之移动。聚合酶可以横跨约聚合酶可以横跨约40个碱基对，而解旋的个碱基对，而解旋的DNA区域区域大约是大约是17个碱基对。个碱基对。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA链上，并形链上，并形成成DNA-RNA杂合体。杂合体。随着聚合酶在模板上的运动，靠近随着聚合酶在模板上的运动，靠近3端的端的DNA不断不断解旋，同时在解旋，同时在5端重新形成端重新形成DNA双链，将双链，将RNA链挤链挤出出DNA-RNA杂合体。杂合体。RNA的的3端大约有端大约有2030个核苷酸与个核苷酸与DNA和聚合酶和聚合酶相结合。相结合。RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promotor)终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开 二、真核生物的二、真核生物的RNApol 1、三种三种RNApol：根据对根据对 -鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感最不敏感 （动、植、昆）（动、植、昆）RNApol 最敏感最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同不同种类的敏感性不同 2、位置和转录产物位置和转录产物 RNApol 核仁核仁 活性所占比例最大活性所占比例最大 转录转录rRNA（、（、18S、28S）RNApol 核质核质 主要负责主要负责 hnRNA、snRNA 的转录的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA）snRNA（核内小分子（核内小分子 RNA small nulear RNA)RNApol 核质核质 负责负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和序列和 部分部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低）（活性较低）真核生物真核生物线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体中还存在中还存在着不同的着不同的RNA聚合酶。聚合酶。线粒体线粒体RNARNA聚合酶只聚合酶只有一条多肽链，相有一条多肽链，相对分子质量小于对分子质量小于7x107x104 4，是已知最小，是已知最小的的RNARNA聚合酶之一，聚合酶之一，与与T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合聚合酶有同源性酶有同源性叶绿体叶绿体RNARNA聚合酶比聚合酶比较大，结构上与细菌较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组亚基由叶绿体基因组编码编码3、亚基组成：、亚基组成：分子量分子量500KDa,含两个大亚基和含两个大亚基和 712 个小亚基个小亚基 RNApol：大亚基中有大亚基中有 C 末端结构域末端结构域 (carboxy terminal domain CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端重复七肽端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）不同生物中重复数目不一样（酶活性）CTD中的中的 Ser和和 Thr可被高度磷酸化可被高度磷酸化 磷酸化的磷酸化的 RNApol 被称为被称为A 非磷酸化的非磷酸化的 RNApol 称为称为B CTD参与转录参与转录 B A 使使 RNApol易于离开易于离开 启动子进入延伸过程（启动子进入延伸过程（10倍）倍）真核生物中共有真核生物中共有3类类RNA聚合酶，它们在细胞核中的位置聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同。不同，负责转录的基因不同。真核生物真核生物RNA聚合酶一般有聚合酶一般有814个亚基个亚基所组成，相对所组成，相对分子质量分子质量超过超过5105。聚合酶中有两个相对分子质量超过聚合酶中有两个相对分子质量超过l10l105 5的大亚基；的大亚基；同种生物同种生物3 3类聚合酶有类聚合酶有 共享共享 小亚基的倾向，即有几个小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中小亚基是其中3 3类或类或2 2类聚合酶所共有的类聚合酶所共有的3类聚合酶类聚合酶的亚基种的亚基种类和大小类和大小存在两条存在两条普遍遵循普遍遵循的原则的原则3.1.2.2 转录复合物转录复合物启启动动子子选选择择阶阶段段RNARNA聚合酶全酶对启动子的识别聚合酶全酶对启动子的识别聚合酶与启动子可逆性结合形成聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物封闭复合物（closed complexclosed complex）伴随着伴随着DNADNA构象上的重大变化，封闭复合构象上的重大变化，封闭复合物转变成物转变成开放复合物开放复合物(open complex)(open complex)开放复合物与最初的两个开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后苷酸之间形成磷酸二酯键后(RNA聚合酶、聚合酶、DNA和新生和新生RNA)三元复合物。三元复合物。强启动强启动子子封闭复合物封闭复合物 开放复合物（不可逆的快反应）开放复合物（不可逆的快反应）真核生物转录起始复合物的分子量很大：真核生物转录起始复合物的分子量很大：RNARNA聚合酶、聚合酶、7 7种辅助因子（包含多个亚基）。种辅助因子（包含多个亚基）。三元复合物可以进入两条不同的反应途径三元复合物可以进入两条不同的反应途径一是合成并释放一是合成并释放2 29 9个核苷酸的短个核苷酸的短RNARNA转录物流产式起始转录物流产式起始;二是尽快释放二是尽快释放亚基，转录起始复合物通亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、过上游启动子区并生成由核心酶、DNADNA和新和新生生RNARNA所组成的转录延伸复合物所组成的转录延伸复合物转转录录的的真真实实性性取取决决于于有特异的转录起始位点有特异的转录起始位点转录起始后按照碱基互补原则准确地转录转录起始后按照碱基互补原则准确地转录模板模板DNADNA序列及具有特异的终止部位序列及具有特异的终止部位因子因子只有带只有带因子因子的全酶才能专一地与的全酶才能专一地与DNADNA上的启动子结合，上的启动子结合，选择其中一条链作为选择其中一条链作为模板，模板，合成均一的产物。合成均一的产物。因子的作用因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责离了起始复合物，而由核心酶负责RNARNA链的延伸。链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。终终止止信信号号转录起转录起始复合始复合物物转录延转录延伸复合伸复合物物RNARNA聚合酶聚合酶较稳较稳定定3.2 3.2 启动子与转录起始启动子与转录起始大肠杆菌大肠杆菌RNARNA聚合酶与启动子的相互聚合酶与启动子的相互作用主要包括作用主要包括启动子区的识别启动子区的识别酶与启动子的结合酶与启动子的结合因子的结合与解离因子的结合与解离 3.2.1 启动子（启动子（promoter）的结构与功能）的结构与功能 （）（）1、启动子由两个部分组成、启动子由两个部分组成 （1）上游部分上游部分 CAP-cAMP结合位点结合位点 （基因表达调控的正控制位点）（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白）的受体蛋白 （2）下游部分下游部分 RNApol的进入（结合）位点的进入（结合）位点 35 10 包括识别位点和结合位点（包括识别位点和结合位点（R B位点）位点）2、RNA聚合酶的进入位点聚合酶的进入位点 （1）Sextama 框（框（Sextama Box）-35序列，序列，RNA聚合酶的松弛（聚合酶的松弛（初始初始）结合位点，）结合位点，RNA聚合酶依靠其聚合酶依靠其亚基识别该位点亚基识别该位点 识别位点（识别位点（R位点）位点）大多数启动子中共有序列为大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性重要性:很大程度上决定了启动子的强度很大程度上决定了启动子的强度 （RNApol 的的因子）因子）位置在不同启动子中略有变动位置在不同启动子中略有变动（2）Pribonow 框（框（Pribonow Box）-10序列，序列，RNA聚合酶的牢固结合位点聚合酶的牢固结合位点 结合位点（结合位点（B 位点）位点）一致序列：一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）位置范围位置范围 4 到到13因此又称因此又称TATA Box保守保守T启动子的研究：启动子的研究：(RNA(RNA聚合酶保护法聚合酶保护法)5 5 RNA聚合聚合酶保护区酶保护区结构基因结构基因 保守序列保守序列 （一一致性序列）致性序列）开始转录开始转录T T G A C AA A C T G T-35 区区(Pribnow box)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 区区1-30-5 010-10-40-205 3 3 5 RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合聚合酶全酶在转录起始区的结合（3）起始位点（起始位点（initiation site）：）：1位点位点 RNA聚合酶的转录起始位点聚合酶的转录起始位点 起始起始NTP多为多为ATP或或GTP (嘌呤嘌呤)起始起始过程过程 ：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 （R位点被位点被因子发现并结合因子发现并结合）b、开放型启动子复合物的形成开放型启动子复合物的形成 RNApol的一个适合位点到达的一个适合位点到达10序列区域，诱导富序列区域，诱导富 含的含的Pribnow 框的框的“熔解熔解”，形成形成1217bp的泡状的泡状 物，同时酶分子向物，同时酶分子向10序列转移并与之牢固结合序列转移并与之牢固结合 开放型启动子复合物使开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向聚合酶定向 两种复合物均为二元复合物（全酶和两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA）c.在开放型的启动子复合物中，在开放型的启动子复合物中，RNApol的的I位点和位点和E位点的位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（亚基）亚基）三元复合物形成三元复合物形成 +1位多为位多为CAT模式模式,位于离开保守位于离开保守T 69 个核苷酸处个核苷酸处 -6-9 bp-GC T ATTGACATATAAT-16-18 bp-+1-35 sequence-10 sequence（4）因子解离因子解离 核心酶与核心酶与DNA的亲和力下降的亲和力下降 起始过程结束起始过程结束核心酶移动进入延伸过程核心酶移动进入延伸过程转录的起始过程转录的起始过程核心酶核心酶1217bp（亚基）亚基）CAP-cAMP 结合位点结合位点（也称（也称CAP位点）位点）转录调控中，转录调控中，I 阻遏蛋白阻遏蛋白 负调控负调控 lac 操纵子模型操纵子模型I 许多基因的表达还存在正调控机制许多基因的表达还存在正调控机制 例如例如:E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时培养基中乳糖和葡萄糖共存时 只有葡萄糖被只有葡萄糖被 利用利用 原因：原因：CAP位点的正调控位点的正调控 葡萄糖缺少时葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将，腺苷酸环化酶将ATP cAMP，cAMP与与CAP位点结合位点结合,此时启动子的进入位点才能此时启动子的进入位点才能 与与RNApol结合结合 葡萄糖存在时，葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有不能形成，没有CAPcAMP 与与CAP位点结合，启动子的位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结进入位点不能结 合合RNApol 因此因此,一个操纵元中有两道控制开关一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开只有同时打开,结构基因结构基因才才 能进行转录。能进行转录。（对（对 lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（1）CAP位点的组成位点的组成（70 40）位点位点：70 70 5050 包括一个包括一个IR 序列序列 强结合位点强结合位点 位点位点：50 50 40 弱结合位点弱结合位点 位点位点对位点对位点具有协同效应（具有协同效应（cooperativity）（2）位点位点结合结合CAPcAMP复合物后，促使复合物后，促使RNApol进入进入 Sextama Box,最终与最终与10序列结合起始转录序列结合起始转录 原因：原因：CAPcAMP复合物与位点复合物与位点结合结合 Sextama Box 富含富含G.C区域（岛区）稳定性降低区域（岛区）稳定性降低 Pribnow Box 的溶解温度降低的溶解温度降低 促进开放型启促进开放型启 动子复合物的形成动子复合物的形成 促进转录促进转录 4、RNApol 在在DNA上结合位点的鉴定上结合位点的鉴定 DNase 法法-40bp 而足迹法（而足迹法（footprinting）结果相对准确结果相对准确 足迹法原理：足迹法原理：限制酶切割结合有限制酶切割结合有RNApol的的DNA 大分子大分子DNA 末端标记该末端标记该DNA（Klenow片段标记片段标记3,碱性磷酸酯碱性磷酸酯 酶标记酶标记5）用内切酶降解用内切酶降解DNA（控制反应条件）（控制反应条件）凝胶电泳分离，放射自显影观察凝胶电泳分离，放射自显影观察限制酶切限制酶切分离分离大片段大片段DNA末端标记大分子末端标记大分子DNA重新结合重新结合RNApol 作对照作对照直接用直接用DNase 进行降解进行降解电泳电泳用微量用微量DNase降解降解电泳电泳 用足迹法鉴定出来的用足迹法鉴定出来的 RNApol 与与DNA的结合区域为的结合区域为 +20 50（40），大约），大约 60 70 bp 实验中还发现实验中还发现.实验中还发现实验中还发现DNADNA的两条链受的两条链受 RNApol RNApol 的保护程度不同，说的保护程度不同，说明明RNApolRNApol与两条链的结合是不与两条链的结合是不对称的，表明转录只需要一条对称的，表明转录只需要一条模板，即单链转录模板，即单链转录 RNA聚合酶聚合酶保护法保护法开始转录开始转录T T G A C AA A C T G T-35 区区T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 区区1-30-5010-10-40-205 3 3 5 原核生物启动子保守序列原核生物启动子保守序列5 5 RNA聚合酶保护区聚合酶保护区结构基因结构基因3 3 原核生物启动子原核生物启动子35区：区：一致性序列为一致性序列为TTGACA是是RNA-pol的的辨认位点辨认位点10区：区：一致性序列为一致性序列为TATAAT又叫又叫Pribnow盒盒是是RNA-pol的的结合位点结合位点 真核生物启动子真核生物启动子 5、启动子各位点与转录效率的关系启动子各位点与转录效率的关系 （1）35 序列与序列与10 序列与转录效率的关系序列与转录效率的关系 标准启动子标准启动子 35 TTGACA 10 TATAAT 不同的启动子不同的启动子 a.与标准启动子序列同源性越高与标准启动子序列同源性越高 启动强度越大启动强度越大 b.与标准启动子同源性越低与标准启动子同源性越低 启动强度越小启动强度越小 c.与标准启动子差异很大时与标准启动子差异很大时 由另一种由另一种因子启动因子启动原因原因:35序列通过被序列通过被 因子识别的容易因子识别的容易 决定启动子强度决定启动子强度 10序列影响开放型启动子复合物形成的速度序列影响开放型启动子复合物形成的速度 决定启动子强度决定启动子强度 启动子上升突变、启动子下降突变启动子上升突变、启动子下降突变 （2）35序列与序列与10序列的间隔区与转录效率的关系序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要碱基序列并不重要 间距非常重要间距非常重要，17bp的间距转录效率最高的间距转录效率最高 间距上的突变种类：间距上的突变种类：间距趋向于间距趋向于17bp 上升突变上升突变 间距远离间距远离17bp 下降突变下降突变各识别的启动子的序列识别的启动子的序列由含由含 70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子杆菌启动子3.2.2 3.2.2 启动子区的识别启动子区的识别在启动子区在启动子区DNADNA双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的某些基团是上的某些基团是氢键供体氢键供体，而，而4 4种碱基中的某些基团是种碱基中的某些基团是氢氢键受体键受体。由于它们分别处于。由于它们分别处于DNADNA双螺旋的双螺旋的大沟或小沟内大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。RNARNA聚合酶不直接识别碱基对本身，聚合酶不直接识别碱基对本身，是通过氢键是通过氢键互补的方式识别启动子的互补的方式识别启动子的3.2.3 3.2.3 酶与启动子区的结合酶与启动子区的结合在在RNARNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链合酶首先与启动子区闭合双链DNAD