仪器分析平面色谱法.ppt

平面色谱法 plane chromatography1色谱分类nGCnLCnSFC柱色谱平面色谱HPCE薄层色谱薄层色谱纸色谱纸色谱薄层电泳薄层电泳2概述n平面色谱法是在平面上进行分离的一种平面色谱法是在平面上进行分离的一种色谱方法色谱方法n是一种基于混合物组分在固定相和流动是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法的方法 3特点：n方便、快速、成本较低，易于推广方便、快速、成本较低，易于推广n样品的预处理比较简单样品的预处理比较简单 n应用范围广应用范围广 n展开剂选择范围宽展开剂选择范围宽 4历史简介n1938年年，俄国人Izmailov和Shraiber首先实现了在氧化铝薄膜上分离一种天然产物。n1949年年，两位美国化学家报导了用薄层色谱法成功地分离了精油中的萜烯。n1958年，年，德国化学家Stahl系统描述了用作涂布薄层的材料（薄层色谱固定相）和涂板设备，对薄层色谱技术也进行了规范化描述。nStahl于1965年年出版了薄层色谱法一书。520世纪80年代n出现了仪器化薄层色谱法，薄层色谱的出现了仪器化薄层色谱法，薄层色谱的每一步均用仪器来代替以往的手工操作，每一步均用仪器来代替以往的手工操作，再配以薄层扫描仪，这样就使薄层色谱再配以薄层扫描仪，这样就使薄层色谱法的定量结果的重现性和准确性大大提法的定量结果的重现性和准确性大大提高。高。6平面色谱参数n定性参数定性参数n相平衡参数相平衡参数n面效参数面效参数n分离参数分离参数7（一）定性参数n比移值比移值（Rf）Rf=L/L0n相对比移值（相对比移值（Rr）Rr=Rf(i)/Rf(s)=Li/Ls 最佳范围最佳范围最佳范围最佳范围 可用范围可用范围可用范围可用范围 8（二）相平衡参数分配系数（分配系数（distrabution coefficient;K）容量因子（容量因子（capacity factor;k）保留比R是在单位时间内一个分子在流动相中出现的几率。在平面色谱中，也可表示组分分子在平面上移动的速度9n当当Vs和和Vm固定时，固定时，Rf 由由K决定决定nK不等是分离的前提不等是分离的前提 n当实验条件固定时当实验条件固定时，K只与组分性质有关只与组分性质有关nRf为为1 的组分，的组分，K与与k为为0，表示该组分不被固，表示该组分不被固定相保留；定相保留；nRf为为0 的组分，的组分，K与与k为为，表示该组分停留在，表示该组分停留在原点，完全被固定相所保留。原点，完全被固定相所保留。10思考题：n下列色谱参数中数值在01之间的是（）ARf Br CR Dk11（三）面效参数n 理论塔板数 L为原点到斑点中心的距离，W为组分斑点的纵向宽度。n塔板高度 H=L0/n L0为斑点到溶剂前沿的距离12（四）分离参数n分离度（分离度（resolution R）n分离数（分离数（separation number SN）R2dW1+W2=13（四）分离参数n分离数（分离数（separation number SN）在相邻峰的分离度为时，在Rf=0及Rf=1两种组分的色谱峰间能容纳的色谱峰数。SN越大，薄层板的容量越大。14第二节 薄层色谱法（thin layer chromatography;TLC）n将细粉状的吸附剂或载体（固定相）涂布于玻璃板、塑料板或铝箔上，成一均匀薄层并进行活化，将混合物样品与对照品溶液点在同一薄板的一端（原点），在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相或展开剂）展开，显色后样品斑点与对照品斑点进行比较，用于定性鉴别或含量测定的方法。15特点n分离能力强，斑点集中n灵敏度高，g ngn展开时间短，minn试样预处理简单，对被分离组分性质没有限制 n上样量较大n所用仪器简单，操作方便16一、薄层色谱法的主要类型n吸附薄层色谱法 固定相为吸附剂固定相为吸附剂 一般极性大的组分移动速度慢一般极性大的组分移动速度慢n分配薄层色谱法 固定相为液体（吸附于载体上），固定固定相为液体（吸附于载体上），固定相极性大于流动相极性时为正相色谱相极性大于流动相极性时为正相色谱 在正相色谱中极性大的组分移动速度慢在正相色谱中极性大的组分移动速度慢17二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂（一）吸附剂n硅胶n氧化铝硅胶具微酸性硅胶具微酸性适于分离酸性和中性物质适于分离酸性和中性物质氧化铝具微碱性氧化铝具微碱性适于分离碱性和中性物质适于分离碱性和中性物质18硅胶n表面带有硅醇基呈弱酸性，硅醇基与极性基团形成氢键而表现其吸附性能，不同组分的极性基团因与硅醇基形成氢键的能力不同而被分离。n硅胶吸水形成水合硅醇基而失去吸附能力，加热（105110）可失去水而提高活度，增加吸附能力，这一过程称为“活化”。n含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，同一组分在此硅胶上的Rf值越大。19氧化铝和硅胶含水量与活性的比较 硅胶含水量%活性级 氧化铝含水量%00531562510381520与硅胶的分离效率有关的是n粒度和孔径 硅胶粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；n表面积 硅胶表面积越大，则与样品之间的相互作用越强，即吸附力越强。21氧化铝n碱性（pH910）分离碱性（生物碱）、中性物质n中性（）广泛n酸性（pH45）酸性、中性22商品出售的薄层色谱用氧化铝和硅胶有：n氧化铝（硅胶）G，表示含有粘合剂煅石膏；n氧化铝（硅胶）H，表示不含有粘合剂；n氧化铝（硅胶）HF254，表示不含粘合剂而含有荧光物质；在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。23（二）展开剂n薄层色谱中的展开是在一个具有一定空间和形状的密闭容器中，展开剂沿薄层（固定相）运动。n通过组分分子与展开剂分子争夺吸附剂表面活性中心而达到分离。24展开剂的选择n主要是根据被分离物质的极性、吸附剂的活度和展开剂的极性三者的相对关系进行选择n先用单一溶剂展开，然后根据分离效果进行调整，经常使用混合展开剂n分离酸碱组分时，展开中加入少量酸、碱。25化合物极性、吸附剂活度和展开剂极性间的关系ABCABC(2)吸附剂(3)展开剂活泼不活泼极性非极性极性非极性(1)被分离物质26三、薄层色谱操作方法n薄层板制备n点样n展开n显色27薄层板制备n玻璃板的大小n软板不加粘合剂n硬板加粘合剂如515%石膏 或 0.250.75%CMC-Na 28点样 n配样溶剂的选择 取决于待分析化合物的类型及其特性，相似相溶。合适的样品浓度应为0.01%0.1%n点样量 影响展开后样品的形状和位置。一般而言，样品量在最小检测限的几倍至几十倍是比较恰当的。点样量一般为几微升。29展开n展开剂流速 展开剂在薄层中的流速与展开剂的粘度、表面张力、吸附剂种类、粒度、均匀度、展开距离等因素有关。薄层板上吸附剂的颗粒越粗，展开剂迁移速度越快；薄层板上吸附剂的颗粒越细且均匀，展开剂移动速度越慢。30展开 n展开器皿 使用的器皿一般为长方形密闭玻璃缸，称为层析缸或色谱缸。n展开方式 常用上行法，另外还有下行法、径向展开、多次展开、双向展开。31展开过程中注意溶剂蒸气饱和n边缘效应 同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，这种现象称为边缘效应。n产生原因n防止边缘效应 密闭容器，先用溶剂蒸气饱和。32显色斑点的定位n n有色物质有色物质 日光下观察n n有紫外吸收有紫外吸收 紫外灯下观察 在荧光背景下呈现暗斑 n n无色物质无色物质 喷洒显色剂 33四、定性和定量分析n定性分析 Rf值n定量分析 洗脱法 直接定量法目视比色法薄层扫描法34五、高效薄层法n高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography；HPTLC）是在现代色谱理论指导下，以经典薄层色谱法为基础发展起来的一种新型薄层色谱技术。35特点n分离效率高n分析速度快n检测灵敏度高等特点 高效薄层色谱法与经典薄层色谱法比较见表18-2 36六、薄层扫描法n用一定波长的光束照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸光度A（或荧光强度F）随展开距离l的变化，所记录的Al（或Fl）曲线称为薄层色谱扫描图，利用薄层扫描图进行定量及定性分析的方法成为薄层扫描法。37薄层吸收扫描法n透过法与反射法n单波长法和双波长法38测定波长的选择n常采用双波长法s 选用被测组分的最大吸收波长，R选用不被被测组分吸收的波长（薄层板的空白吸收）。由于从测量值中减去了薄层本身的空白吸收，所以在一定程度上消除了薄层不均匀的影响，使测定结果准确度提高。39反射法测定n测光方式可分为透射法及反射法 透射法比反射法强度大，但受外界条件的影响较大，使用上受到限制。因此常用反射法40扫描方法n线形扫描快速，但在斑点不规则和浓度不均匀时测量误差较大。n曲折形扫描适用于形状不规则及浓度分布不均匀的斑点。41散射参数的选择n由于吸光度与斑点中组分的量不成线性，即不遵守比耳定律，故校正曲线成弯曲状，需要将其校正为直线。n曲线校正是将散射参数和处理方法存入计算机，计算机根据适当的修正程序，自动进行校正给出符合一定线性关系的数值，从而得到一定线性的定量工作曲线n硅胶薄层板一般选，氧化铝薄层板选。42薄层色谱扫描法的定量分析n外标法n内标法n归一化法 43外标两点法定量44七、薄层色谱的应用及实例n广泛应用于各种天然和合成有机物的分离和鉴定，有时也可用于小量物质的精制。n药品质量监控，可用于测定药物的纯度和检查降解产物。n在生产上可用于判断反应终点，监视反应过程。n对中药和中成药，薄层色谱鉴别应用广泛，可鉴别有效成分，进一步进行含量测定。45实例n判断合成反应进行的程度盐酸普鲁卡因合成过程n药品的鉴别和纯度检查硫酸长春碱的杂质检查n天然药物的鉴别和定量测定六应丸中有效成分的定性和定量46第三节 纸色谱法一、分离原理 纸色谱法（paper chromatography）是以纸为载体的平面色谱法。纸色谱法分离原理属于分配色谱的范畴。与薄层色谱相同，纸色谱也常用比移值Rf来表示各组分在色谱中位置。47n纸色谱中化合物在两相中的分配系数与化合物的分子结构及流动相种类和极性有关，纸色谱属于正相分配色谱。n当流动相一定时，化合物的极性越大或亲水性越强，分配系数越大，Rf值越小；反之亦然。当化合物一定时，流动相极性越大，化合物分配系数越小，Rf值越大。48三种六碳糖的Rf值 六碳糖羟基数目溶剂系统正丁醇-水Rf正丁醇-酸-水(4:1:5)Rf乙酸乙酯-吡啶-水(25:10:35)Rf葡萄糖50.030.170.10鼠李唐40.270.420.44洋地黄毒糖30.580.660.8849二、纸色谱法的实验条件n色谱纸的选择 n固定相 n展开剂的选择 50