细胞热力学研究方法.ppt

四、显微操作技术四、显微操作技术micromanipulation techniquel是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。l包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。显显微微操操作作仪仪第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、离心技术l是分离细胞器及各种大分子基本手段。l转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。l转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。l超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。（一）差速离心（一）差速离心（一）差速离心（一）差速离心 Differential centrifugationDifferential centrifugationl特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。l用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。l沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。l可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。差速离心差速离心Low speedHigh speedDifferential centrifugationVelocity(A)and Equilibrium(B)sedimentation（二）密度梯度离心（二）密度梯度离心l用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。l类型：速度沉降、等密度沉降。l常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。l分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。二、二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖细胞内核酸、蛋白质、酶、糖 与脂类等的显示方法与脂类等的显示方法 原原理理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。l 显示方法显示方法1.金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。3.联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。4.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。5.茚三酮反应：显示蛋白质。Schiff反应反应联苯胺反应联苯胺反应三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性l l免疫细胞化学免疫细胞化学 immunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。（一）免疫荧光法（immunofluorescent technique）：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。（二）（二）（二）（二）蛋白电泳蛋白电泳蛋白电泳蛋白电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)与免疫印迹反应与免疫印迹反应与免疫印迹反应与免疫印迹反应(Western-Blot)(Western-Blot)(Western-Blot)(Western-Blot)免疫印迹免疫印迹(Immunoblotting)(Immunoblotting)或蛋白质印迹或蛋白质印迹(Western blotting)(Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(SDS)和少量巯基乙醇和少量巯基乙醇蛋白质中的多肽链处于伸展状态蛋白质中的多肽链处于伸展状态形成形成SDS-蛋白质复合体蛋白质复合体具有相同的荷质比具有相同的荷质比具有相同的构象具有相同的构象蛋白质蛋白质电泳速度由质量决定电泳速度由质量决定原理原理十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质原态蛋白质磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油（蛋白质疏水区）亲油（蛋白质疏水区）蛋白质样品蛋白质样品电泳电泳荧光素酶或放射性同位素标荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应记的第二抗体起反应通过显色或放射自显影法检通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分测凝胶中的蛋白质成分转膜（硝酸纤维素薄膜）转膜（硝酸纤维素薄膜）非标记抗体（一抗）发非标记抗体（一抗）发生免疫反应生免疫反应Western-BlotWestern-BlotWestern-BlotWestern-Blot方法：方法：方法：方法：（三）（三）免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术：铁蛋白提取繁琐，分子量大，不易进入细胞。免疫酶标技术：反应没有特异性，不能进行感受部位的点对点对应。免疫胶体金技术：胶体金是直径1-100mm的金颗粒分 散在水中形成的金溶胶。特异性强，容易识别。分辨率高。应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等免疫胶体金技术免疫胶体金技术四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性l l分子杂交技术：分子杂交技术：分子杂交技术：分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。原原位位杂杂交交技技术术：用标记的核酸探针通过分子杂交,经经放放射射自自显显影影或或非非放放射射检检测测体体系系，确定特殊核苷酸序列在染色体或细胞中位置的方法。在在组组织织、细细胞胞、间间期期核核及及染染色色体体上上对对核苷酸序列进行定位和相对定量研究的一种手段。进行定位和相对定量研究的一种手段。分分RNARNA原原位位杂杂交交和和染染色色体体原原位位杂杂交交两两大大类类。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。光镜水平的原位杂交技术：光镜水平的原位杂交技术：同位素标记或荧光素标记 的探针 电镜水平的原位杂交技术电镜水平的原位杂交技术：生物素标记的探针与抗生 物素抗体 相连的胶体金标记结合。（一）原位杂交（一）原位杂交（in situ hybridization）1、RNA原位杂交原位杂交标记特异性探针标记特异性探针RNA被固定的组织切片被固定的组织切片若细胞中存在与探针互补的若细胞中存在与探针互补的mRNA分子分子放射自显影或酶促免疫显色放射自显影或酶促免疫显色放射性物质或非放射性（如地高辛、生物素）放射性物质或非放射性（如地高辛、生物素）对该基因的表达产物在细胞水平上做对该基因的表达产物在细胞水平上做出定位定量的分析出定位定量的分析反应反应荧光原位杂交显示的端粒荧光原位杂交显示的端粒 2、荧光原位杂交技术、荧光原位杂交技术FISH（fluorescence in situ hybridization）荧光原位杂交显示的人体着丝粒卫星荧光原位杂交显示的人体着丝粒卫星DNA 荧光素标记探针荧光素标记探针DNA染色体染色体DNA检测荧光素来确定与探针检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的序列杂交的互补序列在染色体或互补序列在染色体或DNA 上的位置上的位置（二）Southern杂交l是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。l将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。分子杂交实验分子杂交实验（三）（三）PCR 技术技术lPCR：是polymerase chain reaction技术简称，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。l反应体系：样品DNA；引物（primer），约15-20个核苷酸；4种dNTP；Tag DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度7580，短时间在95下不失活。缓冲体系和Mg2+。l反应过程：变性：约90-95；复性：约60左右；延伸：70-75；重复“变性复性延伸”过程20-30次循环。待扩增的待扩增的DNA片段片段+dNTP+TrisHCl缓冲液缓冲液+两条引物两条引物+Taq DNA聚合酶聚合酶+Mg 2+95变性变性3060退火退火3072延伸延伸1 l双链双链DNA变性，变性，形成单链模板形成单链模板DNA；l使使引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNA发发生生退退火火作作用用并并结结合合在在靶靶DNA区段两端的互补序列位置上区段两端的互补序列位置上在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物的的3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板按按5 3方方向向延延伸伸，合合成成新新生生DNA互补链。互补链。2530PCR全过程全过程PCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 3-4 3-4 小时小时小时小时五、放射自显影术五、放射自显影术l用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。l原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。l一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。放放射射自自显显影影照照片片