基因工程原理第四章.ppt

第四章第四章 载体载体载体载体(Vector)(Vector)n为什么要有载体？为什么要有载体？外源外源DNADNA转入宿主细胞后常常不能稳定复制转入宿主细胞后常常不能稳定复制n载体是什么？载体是什么？可以在宿主细胞内稳定复制的可以在宿主细胞内稳定复制的DNADNAn载体实现稳定复制的方式载体实现稳定复制的方式 1 1）作为独立的复制子进行复制）作为独立的复制子进行复制 质粒、噬菌体质粒、噬菌体 2 2）可以重组到宿主染色体）可以重组到宿主染色体DNADNA进行复制进行复制 真核载体：酵母、病毒真核载体：酵母、病毒第一节第一节 大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体质粒质粒n原核生物染色体外的稳定原核生物染色体外的稳定复制体复制体,因此可利用作为因此可利用作为克隆载体。有时，也泛指克隆载体。有时，也泛指所有的环状载体所有的环状载体DNADNA。n质粒在琼脂糖电泳时，常质粒在琼脂糖电泳时，常呈三条带，迁移快慢从快呈三条带，迁移快慢从快到慢依次是：超螺旋、线到慢依次是：超螺旋、线性、开环。性、开环。质粒的分类质粒的分类n按是否携带促进细菌接合的转移基因按是否携带促进细菌接合的转移基因(tra(tra基基因因)，分为接合型和非接合型，分为接合型和非接合型n按在单个细胞内的拷贝数，分为松弛型按在单个细胞内的拷贝数，分为松弛型(多多拷贝拷贝)和严紧型和严紧型(低拷贝低拷贝)n一般来说，接合型质粒相对分子量较大，拷一般来说，接合型质粒相对分子量较大，拷贝数少；非接合型质粒分子量较小，拷贝数贝数少；非接合型质粒分子量较小，拷贝数多多质粒的复制起始决定质粒的拷质粒的复制起始决定质粒的拷贝数贝数n质粒具有两种调控起始的主要机制质粒具有两种调控起始的主要机制1)1)通过反义通过反义RNARNA调控调控 现在大部分质粒载体现在大部分质粒载体(ori(ori来自来自ColE1ColE1质质粒粒)的拷贝数调控方式的拷贝数调控方式2)2)通过关键蛋白调控通过关键蛋白调控 质粒克隆载体的理想特性质粒克隆载体的理想特性n相对分子量小相对分子量小(易于操作、拷贝数高、易于操作、拷贝数高、利于出现单一酶切位点利于出现单一酶切位点)n可以在宿主细胞内产生便于选择的表可以在宿主细胞内产生便于选择的表型特性型特性(便于筛选便于筛选)n存在多种限制性酶的单一位点区域，存在多种限制性酶的单一位点区域，且最好位于易测表型基因上且最好位于易测表型基因上(便于克隆、便于克隆、筛选）筛选）pUC8pUC8载体载体n衍生自衍生自pBR322pBR322n含有复制起始含有复制起始位点位点(ori)(ori)和和另两个基因：另两个基因：氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗性基因和性基因和lacZlacZ基因基因LacLac筛选筛选(蓝白斑筛选蓝白斑筛选)蓝白斑筛选：蓝白斑筛选：pUCpUC质粒含质粒含LacZLacZ基因，基因，该酶能分解生色该酶能分解生色底物底物X-galX-gal产生产生蓝色，从而使菌蓝色，从而使菌株变蓝。当外源株变蓝。当外源DNADNA插入插入LacZLacZ基基因后失活，菌株因后失活，菌株呈白色，称之为呈白色，称之为蓝白斑筛选。蓝白斑筛选。pUC8pUC8等大肠杆菌质粒的缺点等大肠杆菌质粒的缺点n不能操作大于不能操作大于10kb10kb的的DNADNA片段片段n大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组制体系，且重组DNADNA分子在宿主细胞中丢失分子在宿主细胞中丢失第二节第二节 噬菌体基因组载体噬菌体基因组载体噬菌体裂解性感染周期与溶噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期源性感染周期n为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。n噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。起复制，称为溶源性感染周期。噬菌体裂解性感染周期与溶源噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期性感染周期噬菌体随意噬菌体随意DNA(optional DNA)DNA(optional DNA)n噬菌体噬菌体基因组大小为，基因组大小为，其中有其中有15kb只在噬菌体只在噬菌体DNA整合到大肠杆菌染整合到大肠杆菌染色体过程色体过程(即溶源性感染即溶源性感染周期周期)中必须，该片段的中必须，该片段的删除不影响删除不影响噬菌体感染噬菌体感染细菌的能力，也不影响细菌的能力，也不影响裂解周期中新的裂解周期中新的噬菌体噬菌体颗粒合成，称为随意颗粒合成，称为随意DNADNA。噬菌体载体噬菌体载体n插入型载体插入型载体(insertion vector)，部分或全部随，部分或全部随意意DNA被删除，并在删被删除，并在删除后的基因组内部某位除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶点引入单一的限制性酶切位点。切位点。n替代型载体替代型载体(replacement vector)，随意随意DNA两侧引入限制两侧引入限制性酶切位点，用需克隆性酶切位点，用需克隆的的DNA在连入时替代随在连入时替代随意意DNA。cos位点与体外包装位点与体外包装ncoscos位点，位点，噬菌体是一噬菌体是一个线性分子，其两端具个线性分子，其两端具有有12个核苷酸、序列互个核苷酸、序列互补的单链突出。补的单链突出。ncoscos位点处可发生连接形位点处可发生连接形成串联体，当所插入片成串联体，当所插入片段大小合适时（连接产段大小合适时（连接产物大小在物大小在37-52kb37-52kb间间)，就会通过体外包装混合就会通过体外包装混合物而包装到衣壳内部。物而包装到衣壳内部。否则，就会被体外包装否则，就会被体外包装混合物切下，不被包装。混合物切下，不被包装。第三节第三节 其它载体其它载体其它载体其它载体n用于连入更长用于连入更长DNADNA片段片段n用于特殊用途：用于特殊用途：1)1)得到单链得到单链DNADNA 2)RNA 2)RNA表达载体表达载体 3)3)蛋白表达载体蛋白表达载体用于连入更长用于连入更长DNADNA片段的载体片段的载体n基因组绘图与测序需要把更长基因组绘图与测序需要把更长(18kb)(18kb)的片段连的片段连入载体入载体n柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)(cosmid)nFosmidsFosmidsn噬菌体噬菌体P1P1载体系统载体系统(bacteriophage P1 vector)(bacteriophage P1 vector)nBAC(bacterial artificial chromosome)BAC(bacterial artificial chromosome)nPAC(P1-derived artificial chromosome)PAC(P1-derived artificial chromosome)nYAC(Yeast artificial chromosome)YAC(Yeast artificial chromosome)nMega-YACMega-YAC用于连入更长用于连入更长DNADNA片段的载体片段的载体CosmidCosmid与与FosmidsFosmidsnCosmidCosmid 1)具有具有coscos位点的质粒，质粒大位点的质粒，质粒大小小5-8kb 2)具有和具有和噬菌体一样的感染性噬菌体一样的感染性 3)进入细胞后不能指导合成新的进入细胞后不能指导合成新的噬菌体颗粒，而是如质粒一样复噬菌体颗粒，而是如质粒一样复制，因此重组制，因此重组DNA可以从克隆而可以从克隆而不是噬菌斑中得到不是噬菌斑中得到nFosmidsFosmids 包含了包含了F F质粒的复制起始位点和质粒的复制起始位点和载体载体coscos位点。与位点。与Cosmid相似，相似，但拷贝数较低但拷贝数较低酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)(YAC)n在酵母中繁殖，是在酵母中繁殖，是以染色体为根据。以染色体为根据。n真核染色体的三个真核染色体的三个重要组件重要组件 1)1)着丝粒着丝粒 2)2)端粒端粒 3)3)一个或多个复制一个或多个复制起始点起始点YACYAC载体工作原理载体工作原理YACYAC的优点与缺点的优点与缺点n优点：天然酵母染色体大小为优点：天然酵母染色体大小为230-230-1700kb,1700kb,因此能插入上至因此能插入上至MbMb的片段的片段n缺点：插入不稳定，克隆的缺点：插入不稳定，克隆的DNADNA会存在会存在重排现象，形成新的序列组合。重排现象，形成新的序列组合。BACBACnBACBAC是基于大肠杆菌是基于大肠杆菌F F质粒构建的。细菌质粒构建的。细菌F F质粒是一种较大的质粒是一种较大的质粒，具有插入较质粒，具有插入较大片段的能力，可大片段的能力，可以克隆以克隆300kb300kb及更长及更长的片段，且插入片的片段，且插入片段很稳定。段很稳定。噬菌体噬菌体P1P1载体系统与载体系统与PACPACn噬菌体噬菌体P1P1载体系载体系统与统与载体类似，载体类似，但是基因组更大但是基因组更大，具有插入更大片具有插入更大片段的能力，可以段的能力，可以克隆克隆125kb125kb的片的片段。段。nPACPAC综合了综合了P1P1载载体系统和体系统和BACBAC的的特点，具有克隆特点，具有克隆长达长达300kb300kb片段片段的容量。的容量。用于特殊用途的载体用于特殊用途的载体n用于特殊用途：用于特殊用途：1)1)得到单链得到单链DNADNA 2)2)得到得到RNARNA探针和双链探针和双链RNARNA 3)3)蛋白质表达载体蛋白质表达载体 a)a)最大量合成蛋白最大量合成蛋白 b)b)简化蛋白纯化简化蛋白纯化 c)c)促进蛋白溶解促进蛋白溶解 d)d)促进蛋白外运促进蛋白外运用于得到单链用于得到单链DNADNA的载体的载体nDNADNA测序、测序、S1S1核酸酶核酸酶作图、寡核苷酸诱作图、寡核苷酸诱变等分子生物学操变等分子生物学操作需要得到单链作需要得到单链DNADNAnM13M13载体载体表达载体表达载体n用于表达用于表达RNARNA和大量蛋白的载体和大量蛋白的载体n载体启动子经过优化，有利于大肠杆载体启动子经过优化，有利于大肠杆菌菌RNARNA聚合酶的结合聚合酶的结合n分为分为RNARNA表达载体和蛋白表达载体表达载体和蛋白表达载体用于得到用于得到RNARNA探针的表达载体探针的表达载体n用噬菌体启动用噬菌体启动子子 1)1)活性强活性强 2)2)大肠杆菌启大肠杆菌启动子不识别动子不识别 3)3)噬菌体所编噬菌体所编码码RNARNA聚合酶，聚合酶，如如SP6,T7SP6,T7和和T3,T3,是单独多是单独多肽链，比大肠肽链，比大肠杆菌的酶更易杆菌的酶更易于操作于操作用于得到双链用于得到双链RNARNA的载体的载体n具有方向不同具有方向不同的双启动子载的双启动子载体体nLITMUSLITMUS载体：载体：具有相反方向的具有相反方向的T7T7启动子，通启动子，通过限制酶线性过限制酶线性化的差异实现化的差异实现不同链的转录不同链的转录LITMUSLITMUS载体工作原理载体工作原理影响克隆基因蛋白表达的因素影响克隆基因蛋白表达的因素n启动子的强度启动子的强度n转录终止转录终止n质粒拷贝数质粒拷贝数n质粒稳定性质粒稳定性n宿主细胞生理状况宿主细胞生理状况n翻译起始序列翻译起始序列n密码子选择密码子选择nmRNAmRNA结构结构用于最大量合成蛋白的载体用于最大量合成蛋白的载体n含有可控制的启动子：含有可控制的启动子：1)PL 2)T7 3)trc(tac)4)BADn通过诱导实现最大量的表达通过诱导实现最大量的表达trctrc与与tactac：laclac与与trptrp启动子的启动子的杂合，可受乳糖与杂合，可受乳糖与IPTGIPTG调控调控pETpET载体：载体：T7T7启动子启动子PL启动子调控：启动子调控：clcl和和trptrp调控调控pBADpBAD载体：载体：BADBAD启动子启动子简化蛋白纯化的载体：标签蛋简化蛋白纯化的载体：标签蛋白的引入白的引入n谷胱甘肽谷胱甘肽-S-转移酶转移酶(GST)谷胱甘肽琼脂糖谷胱甘肽琼脂糖n麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白(MalE)直链淀粉树脂直链淀粉树脂n多组氨酸多组氨酸(His-tag)镍柱镍柱n生物素生物素 亲和素亲和素/链酶抗生物素链酶抗生物素简化蛋白纯化的载体：亲和纯简化蛋白纯化的载体：亲和纯化化促进蛋白溶解和外运的载体：促进蛋白溶解和外运的载体：避免包含体的形成避免包含体的形成n包含体：过量表达的不可溶蛋白包含体：过量表达的不可溶蛋白n硫氧还蛋白融合蛋白的引入硫氧还蛋白融合蛋白的引入n分泌信号蛋白的引入分泌信号蛋白的引入n现代表达载体实际上多种特性的整合现代表达载体实际上多种特性的整合物物