凝胶过滤层析法纯化牡蛎碱性磷酸酶.ppt

实验十 凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶一、目的要求1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化色谱的历史知识层析 色谱 Chromatography茨维特（Mikhail Tswett，俄国植物学家），1901年，植物色素分离1952 年，James 和Martin 发明了气相色谱，获得1952 年的诺贝尔化学奖用于生物分子分离分析的色谱技术液相色谱（常压液相色谱、高压液相色谱-HPLC）、吸附色谱（柱色谱、薄层色谱）、离子交换色谱、亲和色谱、金属螯合色谱（“镍柱”）、排阻色谱（凝胶色谱）二、原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。优点：a.条件温和 b.操作简便 c.损失少回收率高 d.层析柱可反复使用凝胶的类型：Sephadex:交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D700150050001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000凝胶及柱的选择凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。装柱的两种方法：a.手工操作 1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床打开出水口连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9）样品上柱分析用量：柱床体积的12%制备用量：柱床体积的1020%洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰四、操作方法（一）凝胶的选择与处理1.凝胶及柱的选择选择Sephadex G50和1.5cm60cm的柱子。2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。（二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。实验步骤1、按图示排列将凝胶柱及各仪器连接好。（1）凝胶柱的出水口与紫外检测仪的进水口（打“”符号者）连接，通过软管将紫外检测仪的出水口（打“”符号者）与部分收集器连接；（2）用红、黑两条连接线将紫外检测仪与记录仪相连接“红接红”、“黑接黑”；2、依次打开紫外检测仪、部分收集器、记录仪开关，对仪器进行预热。3、通过“量程/零位”切换开关，设定记录仪的量程为“10mv”，取下记录笔的笔套，检查记录笔是否可书写。4、转动紫外检测仪右侧板上的波长旋钮，设定检测波长为280nm。5、打开凝胶柱出水口的夹子，使洗脱缓冲液流经检测器。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使检测仪窗口数字显示为100，即透光率为100%。再将“灵敏度”开关转到“0.5A”档，缓慢调节“调零”旋钮，检测仪数字显示为“0”，并使记录仪指针在“0”位。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。（注意：在样品检测的过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮！）6、完成以上步骤后，进行流速检测，记下凝胶柱中洗脱液流出2ml所需的时间，并以此时间对部分收集器进行定时。7、部分收集器的使用：（1）按下“手动/自动”键，使收集器处于“手动”状态，在此状态下设置定时时间；（2）按“选择”键，每按一次移动一位，根据第6步的结果设定定时时间。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间，时间设定后再按一次选择键，即完成定时时间的设定。（注意：定时的时间单位为分钟，即本型号仪器的最小定时时间为1 1分钟）8、加样检测（1）打开驻上端的螺丝帽塞子，用滴管吸出层析住中多余的溶液直至液面与胶面相切。（2）沿着柱管壁将1ml碱性磷酸酶样品小心加入到凝胶床面上（注意不可将凝胶胶面冲起），打开出水口夹子，使样品溶液进入胶面内，直同时收集流出液，至液面与胶面相切时，将出水口夹紧。（3）按上述加样的操作，以洗脱缓冲液洗涤柱管壁两次，每次1ml。最后加入3-4ml洗脱缓冲于凝胶柱中，重新装上上口螺丝帽，柱进水管与架上洗脱液试剂瓶相连。（4）打开凝胶柱出水口的夹子，使已设定好定时收集时间的部分收集器处于自动收集状态，并开动记录仪进行记录。记录仪走纸速度设定为2mm/min。五、注意事项1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。六、思考题1.在本实验中要注意哪些重要环节？