南农生物分离工程生物分离1-细胞破碎.ppt

CellMembranes细胞膜细胞膜 Summary概述概述 ChemicalMethods机械破碎机械破碎 mechanicaldisruption非机械破碎非机械破碎细胞破碎技术细胞破碎技术概述概述有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，使胞使胞使胞使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁内产物释放出来一般需要破碎细胞壁内产物释放出来一般需要破碎细胞壁内产物释放出来一般需要破碎细胞壁 。分分类类 机械法机械法机械法机械法非机械法非机械法非机械法非机械法固体剪切法固体剪切法固体剪切法固体剪切法(珠磨法珠磨法珠磨法珠磨法)酶溶法酶溶法酶溶法酶溶法液体剪切法液体剪切法液体剪切法液体剪切法化学降解法（酸碱法）化学降解法（酸碱法）化学降解法（酸碱法）化学降解法（酸碱法）撞击法撞击法撞击法撞击法表面活性剂法表面活性剂法表面活性剂法表面活性剂法超声法超声法超声法超声法干燥法干燥法干燥法干燥法渗透法渗透法渗透法渗透法冻融法冻融法冻融法冻融法本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNADNADNADNA上。上。上。上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。细胞膜细胞膜Gram-negativeprocaryotes革兰氏阴性原核生物革兰氏阴性原核生物（）（）革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约8mm8mm8mm8mm厚，酶大多数厚，酶大多数厚，酶大多数厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白质分子和金属离子。质分子和金属离子。质分子和金属离子。质分子和金属离子。这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细胞有一定的机械强度；破坏该层是本章讨胞有一定的机械强度；破坏该层是本章讨论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将代谢物排出胞外。代谢物排出胞外。真核细胞，具有真正的细胞核，其结构要比真核细胞，具有真正的细胞核，其结构要比原核生物复杂的多，以图所示的酵母菌为例，原核生物复杂的多，以图所示的酵母菌为例，和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞膜。膜。动物细胞动物细胞植植物物细细胞胞模模式式图图 破壁难易程度破壁难易程度 与壁强度、壁厚度、聚合物的种类、与壁强度、壁厚度、聚合物的种类、细胞的形状和大小有关细胞的形状和大小有关 细菌比真菌易破碎细菌比真菌易破碎 G G+用溶菌酶用溶菌酶 G G-添加添加EDTAEDTA，除去，除去CaCa2+2+细胞破碎理论细胞破碎理论 1)、细胞破碎、细胞破碎A 压撞 B 剪切 C渗透 冻胀 D 破壁破膜2)2)、产物释放、产物释放、产物释放、产物释放方法方法方法方法技术技术技术技术原理原理原理原理效果效果效果效果成本成本成本成本举例举例举例举例机械法机械法机械法机械法匀浆法（片型）匀浆法（片型）匀浆法（片型）匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中适中适中适中适中适中适中动物组织及动动物组织及动动物组织及动动物组织及动物细胞物细胞物细胞物细胞研磨法研磨法研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中适中适中便宜便宜便宜便宜超声波法超声波法超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中适中适中昂贵昂贵昂贵昂贵细胞悬浮液小细胞悬浮液小细胞悬浮液小细胞悬浮液小规模处理规模处理规模处理规模处理匀浆法（孔型）匀浆法（孔型）匀浆法（孔型）匀浆法（孔型）须使细胞通过的小须使细胞通过的小须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈剧烈剧烈适中适中适中适中细胞悬浮液大细胞悬浮液大细胞悬浮液大细胞悬浮液大规模处理规模处理规模处理规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈剧烈剧烈便宜便宜便宜便宜细胞悬浮液和细胞悬浮液和细胞悬浮液和细胞悬浮液和植物细胞的大植物细胞的大植物细胞的大植物细胞的大规模处理规模处理规模处理规模处理一、机械法高速珠磨机高速珠磨机珠直径、数量、悬浮液浓度、搅拌速度珠直径、数量、悬浮液浓度、搅拌速度珠磨法珠磨法WSK卧式高效全能珠磨机Crushinginballmill珠磨法珠磨法ZM系列系列卧式密卧式密闭珠珠(砂砂)磨机磨机高压匀浆器影响因素影响因素操作压力操作压力操作压力操作压力p p：p p,R,R 。温度。温度 2 2 C/10MPa C/10MPa。破碎次数破碎次数破碎次数破碎次数NN：N N，R R 。温度温度温度温度：比速度比速度k k与温度有关，温度与温度有关，温度 2525 C C，k k 倍。倍。细胞种类：细胞种类：细胞种类：细胞种类：如大肠杆菌比酵母易破碎如大肠杆菌比酵母易破碎如大肠杆菌比酵母易破碎如大肠杆菌比酵母易破碎超声波破碎(1525kHz)1525kHz)机理在 超 声 作 用 下 产 生 的 空 穴 化 作 用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。发声器和换能器发声器和换能器 高频电流高频电流 机械振动机械振动 功率、工作时间（功率、工作时间（9S9S）、间歇时间、工作次数、）、间歇时间、工作次数、产热大、实验室产热大、实验室 Ultrasonication超声波超声波超声波破碎仪 超声破碎法超声破碎法超声破碎法超声破碎法优点：适合于多种细胞的破碎缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温；D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。JJ-2组织捣碎匀浆机研钵研钵机械法机械法优点优点优点优点A A、在在大大规规模模cellcell破破碎碎中中，高高压压匀匀浆浆机机和和珠珠磨磨机机用用得得最多最多;B B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌、高压匀浆机最适合于酵母和细菌;C C、珠珠磨磨机机可可用用于于酵酵母母和和细细菌菌，但但对对真真菌菌菌菌丝丝和和藻藻类更合适类更合适.二、非机械法 方法方法方法方法技术技术技术技术原理原理原理原理效果效果效果效果成本成本成本成本举例举例举例举例化学法化学法化学法化学法渗透冲击渗透冲击渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和温和温和便宜便宜便宜便宜血红细胞的破血红细胞的破血红细胞的破血红细胞的破坏坏坏坏酶消化法酶消化法酶消化法酶消化法细胞壁被消化，使细胞壁被消化，使细胞壁被消化，使细胞壁被消化，使细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎温和温和温和温和昂贵昂贵昂贵昂贵增溶法增溶法增溶法增溶法表面活性剂溶解细表面活性剂溶解细表面活性剂溶解细表面活性剂溶解细胞壁胞壁胞壁胞壁温和温和温和温和适中适中适中适中胆盐作用于大胆盐作用于大胆盐作用于大胆盐作用于大肠杆菌肠杆菌肠杆菌肠杆菌脂溶法脂溶法脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细胞有机溶剂溶解细胞有机溶剂溶解细胞有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳壁并使之失稳壁并使之失稳壁并使之失稳适中适中适中适中便宜便宜便宜便宜甲苯破碎酵母甲苯破碎酵母甲苯破碎酵母甲苯破碎酵母细胞细胞细胞细胞碱处理法碱处理法碱处理法碱处理法碱的皂化作用使细碱的皂化作用使细碱的皂化作用使细碱的皂化作用使细胞壁融解胞壁融解胞壁融解胞壁融解剧烈剧烈剧烈剧烈便宜便宜便宜便宜化学法化学法Osmotic Shock(渗透冲击法渗透冲击法)最简单的是渗透冲击法。最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂，释放胞内物。使细胞膨胀，最后导致破裂，释放胞内物。细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被机胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分，通过渗透流很难渗透。分，通过渗透流很难渗透。渗透流的动力来自渗透压，渗透压可以通渗透流的动力来自渗透压，渗透压可以通过化学平衡来估算：过化学平衡来估算：P=RTC 该式称为范特苛夫定律。该式称为范特苛夫定律。许多细胞内溶质浓度大约为许多细胞内溶质浓度大约为0.1MNaCl或或溶质溶质。例：例：一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子量卤化物，适应高渗透压，能在含有量卤化物，适应高渗透压，能在含有223 的的培养基中培养，当其从含盐量高的培养基培养基中培养，当其从含盐量高的培养基中转移至清水中，在数分钟内能将胞内产中转移至清水中，在数分钟内能将胞内产物释放出来，试估计细胞膜所受渗透压的物释放出来，试估计细胞膜所受渗透压的大小。（设操作温度为大小。（设操作温度为25）解：细胞所受渗透压按照下式计算：解：细胞所受渗透压按照下式计算：P RTC 8.314298(0.3220.0230.01530.014)1031.94106 Pa酶解法阳性菌：阳性菌：溶菌酶溶菌酶，分解糖苷键，低渗溶液破裂，分解糖苷键，低渗溶液破裂阴性菌：阴性菌：EDTA-EDTA-溶菌酶溶菌酶、甘氨酸、甘氨酸-溶菌酶、溶菌酶、青霉素法（抑制细胞壁合成）青霉素法（抑制细胞壁合成）酵母菌：蜗牛酶、纤维素酶酵母菌：蜗牛酶、纤维素酶霉菌：几丁质酶、壳聚糖酶霉菌：几丁质酶、壳聚糖酶自溶作用：加热、干燥诱发自溶作用：加热、干燥诱发冻-融法 细胞细胞-15-15冷冻、室温融化冷冻、室温融化 细胞膜疏水键破裂，胞内水结晶膨胀破裂细胞膜疏水键破裂，胞内水结晶膨胀破裂 温和、破碎率低温和、破碎率低干燥法干燥法 细胞膜渗透性改变，易抽提（丙酮、丁醇）细胞膜渗透性改变，易抽提（丙酮、丁醇）空气干燥（酵母）空气干燥（酵母）25-3025-30热空气热空气 真空干燥（细菌）真空干燥（细菌）喷雾、冷冻干燥（不稳定生化物质）喷雾、冷冻干燥（不稳定生化物质）非机械法优点：优点：优点：优点：A A、产品释放的选择性；、产品释放的选择性；B B、提取速度和收效高；、提取速度和收效高；C C、产品的破坏小；、产品的破坏小；D D、对外界环境，如、对外界环境，如pHpH和温度等要求低。和温度等要求低。机械法和非机械法的比较机械法和非机械法的比较 机械破碎法缺点：机械破碎法缺点：机械破碎法缺点：机械破碎法缺点：A A、高高能能、高高温温、高高噪噪音音、高高剪剪切切力力(四四高高)，易易使使产产品品变变性性失活；失活；B B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C C、细胞碎片大小不一，难分离。、细胞碎片大小不一，难分离。非机械破碎法缺点：非机械破碎法缺点：非机械破碎法缺点：非机械破碎法缺点：A A、引起新的污染，尤其是其他化学方法；、引起新的污染，尤其是其他化学方法；B B、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。细胞破碎的评价 破碎率定义破碎率定义破碎率定义破碎率定义N N0 0：原原细细胞胞数数，N N：破破碎碎后后残残存存的的正正常常细细胞胞。N N0 0和和N N的的可可通过直接计数和间接计数法得到。通过直接计数和间接计数法得到。直接计数法直接计数法直接计数法直接计数法方法方法方法方法：样本稀释：样本稀释-染色染色-上样上样 计数。计数。计算计算计算计算：同上。：同上。优点优点优点优点：方法简单。：方法简单。缺点缺点缺点缺点：A A、计数时间长、计数时间长 B B、细胞聚集时，不利计数、细胞聚集时，不利计数 C C、染色误差。、染色误差。细胞破碎的评价细胞破碎的评价间接计数法间接计数法间接计数法间接计数法方方方方法法法法：样样本本离离心心 -取取上上清清液液 -测测特特定定蛋蛋白白质质或或酶酶 -与理论的最大值比较。与理论的最大值比较。(紫球藻细胞紫球藻细胞 藻红蛋白藻红蛋白)计算：计算：计算：计算：Y(%)=100(Y(%)=100(R/RR/Rm m)R Rm m：理论最大值，：理论最大值，R R：实验测得值。：实验测得值。优优优优点点点点：A A、方方法法客客观观可可靠靠，尤尤其其对对蛋蛋白白质质和和酶酶，B B、有有多多种种选选择择的的指指标标，胞胞内内位位置置(如如胞胞膜膜、胞胞壁壁、近近胞胞膜膜蛋蛋白白等等)，灵活性大。灵活性大。缺点缺点缺点缺点：影响因素多，如温度、：影响因素多，如温度、pHpH值、剪切力、溶液的稀释等。值、剪切力、溶液的稀释等。解决办法解决办法解决办法解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。：筛选相对稳定和恒定的指标。基因工程表达产物基因工程表达产物存在的问题存在的问题存在的问题存在的问题A A、包含体、包含体B B、N-N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌）端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌）C C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母）、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母）D D、大肠杆菌的内毒素、大肠杆菌的内毒素包含体（一般步骤）包含体（一般步骤）包含体（一般步骤）包含体（一般步骤）A A、包含体的分离、包含体的分离B B、包含体溶解、变性、包含体溶解、变性、还原还原，一般用尿素、盐酸胍、，一般用尿素、盐酸胍、SDSSDSC C、变形蛋白质的复性、变形蛋白质的复性D D、一般的分离纯化、一般的分离纯化基因工程表达产物基因工程表达产物例：人例：人例：人例：人 -干扰素的后处理工艺干扰素的后处理工艺干扰素的后处理工艺干扰素的后处理工艺发酵液发酵液发酵液发酵液 离心离心(发酵液冷却至发酵液冷却至1010 C C以下，以下，4000r/min4000r/min离心离心10min)10min)菌体菌体菌体菌体 细细胞胞破破碎碎(1(1倍倍体体积积细细胞胞+10+10倍倍体体积积 buffer,buffer,冰冰浴浴超超声声破破碎碎5 5次次,30s/30s/次次,4000r/min4000r/min离离心心30min)30min)，洗洗涤涤(0.1%(0.1%Triton Triton X-100X-100溶液，溶液，1000r/min1000r/min离心离心20min20min，重复三次，重复三次)包含体包含体包含体包含体 提提取取变变性性(包包含含体体+8M+8M 尿尿素素 pH pH 8.0 8.0 50mM 50mM Tris-HCl Tris-HCl buffer buffer 0.2 0.2 mM mM EDTA,EDTA,10mM 10mM DTTDTT室室 温温 搅搅 拌拌 2h,2h,离离 心心(15000r/min,30min)(15000r/min,30min)DTTDTT二硫苏糖醇二硫苏糖醇用于蛋白质用于蛋白质二硫二硫键的裂解键的裂解 基因工程表达产物基因工程表达产物变性液变性液变性液变性液 稀稀释释(取取1 1份份变变形形液液+99+99份份上上述述buffer(buffer(不不含含DTT)DTT)，使使尿尿素素浓度小于，浓度小于，4 4 C C下搅拌下搅拌24h24h）复性液复性液复性液复性液 浓浓缩缩(用用截截留留10000D10000D的的超超滤滤器器浓浓缩缩100100倍倍)，透透析析后后离离心心(15000r/min(15000r/min离心离心30min)30min)浓缩上清液浓缩上清液浓缩上清液浓缩上清液Sephacryl s-200Sephacryl s-200柱层析分离柱层析分离柱层析分离柱层析分离 层层析析柱柱2 2 100cm100cm，pH pH 8.0 8.0 50mM 50mM Tris-HCl Tris-HCl buffer buffer 平平衡衡洗洗脱脱收集主峰、冻干、终产物收集主峰、冻干、终产物(纯度可达纯度可达100%100%，DNADNA及热源合格及热源合格)