吲哚乙酸氧化酶活性的测定.ppt
P144 熟悉运用比色法测定吲哚乙酸熟悉运用比色法测定吲哚乙酸氧化酶活力的方法，并掌握测定酶氧化酶活力的方法，并掌握测定酶活力的基本要求。活力的基本要求。实验目的实验目的实验原理实验原理 吲吲哚哚乙乙酸酸在在吲吲哚哚乙乙酸酸氧氧化化酶酶的的作作用用下下，被被氧氧化化破破坏坏失失去去活活力力。植植物物体体内内吲吲哚哚乙乙酸酸氧氧化化酶酶活活力力的的大大小小，对对调调节节体体内内吲吲哚哚乙乙酸酸的的水水平平起起着着重重要要的的作用，从而影响植物的生长。作用，从而影响植物的生长。酶酶活活力力的的大大小小可可以以其其破破坏坏吲吲哚哚乙乙酸酸的的速速度度表表示。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。示。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。IAA+FeCl3 红色螯合物红色螯合物绿豆芽的下胚轴绿豆芽的下胚轴绿豆芽的下胚轴绿豆芽的下胚轴 。实验材料实验材料上胚轴上胚轴:子叶到第子叶到第1片真叶之间的部分片真叶之间的部分下胚轴下胚轴:子叶与根之间的一部分子叶与根之间的一部分下下下下胚胚胚胚轴轴轴轴取取材材部部位位 处处理理：在在试试管管中中加加入入：MnCl2 1ml+2，4-二二氯酚氯酚1ml+IAA 2 ml+酶液酶液1 ml+磷酸缓冲液磷酸缓冲液5ml 对对照照：在在试试管管中中加加入入：MnCl2 1 ml+2,4-二二氯氯酚酚1ml+IAA 2 ml+磷酸缓冲液磷酸缓冲液6ml 称称取取1g下下胚胚轴轴，置置于于研研钵钵中中，加加入入预预冷冷的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液(pH=6.1)1ml，研研磨磨成成匀匀浆浆，再再用用9ml分分2次次冲冲洗洗，总总体体积积为为10ml。离离心心4000rpm 10min，所得的上清夜即为粗酶液。，所得的上清夜即为粗酶液。IAA含量的测定含量的测定方法步骤方法步骤标准曲线的绘制。标准曲线的绘制。IAA氧化酶需要两个辅助因子：氧化酶需要两个辅助因子：一元酚和二价离子一元酚和二价离子 Mnq计算计算时间时间(h)IAA氧化酶活力氧化酶活力=(gIAA/hml)对照对照处理处理(g/ml)10q保温：保温：30温箱中温箱中30min；q显色：三支试管中分别加入处理液、对照液、显色：三支试管中分别加入处理液、对照液、蒸馏水各蒸馏水各2ml后，再分别加入试剂后，再分别加入试剂A8ml，摇匀，摇匀，40黑暗处黑暗处30min(15-20min)；q用分光光度计在用分光光度计在530nm波长处测波长处测A值；值；q查标准曲线；查标准曲线；v简述简述简述简述IAA IAA 氧化酶活力测定的原理。氧化酶活力测定的原理。氧化酶活力测定的原理。氧化酶活力测定的原理。v制备酶液时，为何加入制备酶液时，为何加入制备酶液时，为何加入制备酶液时，为何加入pH 6.1 pH 6.1 的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。v酶促反应时，为何要加入酶促反应时，为何要加入酶促反应时，为何要加入酶促反应时，为何要加入MnClMnCl2 2和和和和2 2，4-4-二氯酚。二氯酚。二氯酚。二氯酚。v比色时，为何要选在比色时，为何要选在比色时，为何要选在比色时，为何要选在530nm530nm波长处？波长处？波长处？波长处？v现现现现有有有有黄黄黄黄豆豆豆豆芽芽芽芽、绿绿绿绿豆豆豆豆芽芽芽芽两两两两种种种种材材材材料料料料，测测测测定定定定黄黄黄黄豆豆豆豆芽芽芽芽的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度值值值值为为为为A A1 1，绿绿绿绿豆豆豆豆芽芽芽芽的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度值值值值为为为为A A2 2，且且且且A A1 1AA2 2，试试试试比比比比较较较较这这这这两两两两种种种种材材材材料料料料下下下下胚胚胚胚轴轴轴轴中中中中哪哪哪哪个个个个IAAIAA氧氧氧氧化化化化酶酶酶酶活活活活力大，为什么？力大，为什么？力大，为什么？力大，为什么？实验实验（设计性实验）（设计性实验）结果总结结果总结培养基培养基接种数接种数(瓶瓶*片）片）最早出愈最早出愈 时间时间 （d）出愈率出愈率（%）污染率污染率（%）愈伤生长愈伤生长 情况情况MS+2,4-D1.013*31897.437.69 切口切口处较处较多出多出愈，黄色愈，黄色颗颗粒粒状，偶状，偶见见灰白灰白色愈色愈伤伤 MS+2,4-D1.0+6-BA0.412*3171000切口及与培养切口及与培养基接触基接触处处生生长长愈愈伤伤，黄色透，黄色透明，明，较较湿湿润润 MS+2,4-D1.0+6-BA1.012*3161000切口及与培养切口及与培养基接触基接触处处生生长长愈愈伤伤，黄白色，黄白色，湿湿润润 不同培养基对怀地黄愈伤组织生长情况的影响结果总结结果总结I型愈伤组织型愈伤组织型愈伤组织型愈伤组织型愈伤组织型愈伤组织培养基培养基（mg/L)接种数接种数（瓶（瓶*株）株）出芽时间出芽时间(d)平均叶平均叶片数片数（个（个/株）株）增值系数增值系数MS+NAA 0.0213*32022MS+NAA 0.02+6-BA0.212*31544MS+NAA0.02+6-BA0.514*31055不同培养基对怀地黄试管苗生长情况的影响
