《仪器分析》第八章液相色谱分析.ppt

液相色谱法1.了解液相色了解液相色谱法的法的优点及适用范点及适用范围2.理解常用理解常用检测器原理、器原理、优缺点及适用范缺点及适用范围3.理理解解各各种种分分离离方方式式的的原原理理、适适用用的的分分析析对象象及及选择原原则4.理理解解超超临界界流流体体色色谱法法的的原原理理、优缺缺点点及及适适用范用范围HPLC与与GC的区的区别：GC流流动相惰性，相惰性，HPLC流流动相与相与组分有作用分有作用HPLC一一般般在在室室温温下下进行行、GC多多在在高高温温下下进行行应用用范范围全全部部色色谱分分离离对象象的的20GC，HPLC约占占80HPLC更适合于制更适合于制备1）液体的）液体的扩散系数比气体的小倍左右；散系数比气体的小倍左右；2）液体粘度比气体）液体粘度比气体约大大100倍；倍；3）液体表面）液体表面张力比气体大力比气体大104倍；倍；4）液体密度）液体密度约大大1000倍；倍；5）液体比气体不可）液体比气体不可压缩。1 固定相和流动相固定相和流动相（1）固定相）固定相按照承受压力来分：刚性性固固体体硅胶，耐高压，表面可键合各种功能团 硬硬胶胶聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承压能力低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱按照孔隙深度来分：表表面面多多孔孔型型实心玻璃外面覆盖一层多孔活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂和聚酰胺等，厚度12m，以形成无数向外开放的浅孔。全全多多孔孔微微粒粒型型由直径为10-3数量级的硅胶微粒凝聚而成，颗粒细，孔浅，相对死体积小，出峰快，柱效高，但需要更高的操作压力。最大允许进样量比表面多孔型大5倍（2）流）流动相相 纯度高 粘度低 化学稳定性好 沸点高于55C 溶剂要完全浸润固定相 与检测器匹配2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪1）储液器；液器；2）脱气器；）脱气器；3）高）高压泵；4）进样器；器；5）色）色谱柱；柱；6）检测器。器。主要部件：主要部件：(1)储液器液器耐腐蚀、配2m镍合金过滤器(2)脱气装置脱气装置氦气鼓泡来驱除溶在溶剂中的气体(3)高高压泵输送流动相，压力几Mpa至数十MPa。无脉动或者脉动很小流量稳定可调、耐腐蚀、密封性好恒恒压泵：压力恒定，力恒定，泵腔体腔体积大，流量随外界阻力改大，流量随外界阻力改变而改而改变，逐，逐渐被恒流被恒流泵取代取代 气气动放大放大泵恒流恒流泵：流量恒定：流量恒定 往复活塞往复活塞泵、螺旋、螺旋传动注射注射泵(4)梯度洗脱装置梯度洗脱装置类似于气相色谱中的程序升温两种、三种或者四种溶剂按照比例进行混合，进行二元、三元、四元梯度淋洗优点：改善峰形、提高柱效、分析时间减少；缺点：更换流动相达到平衡的时间需要更长常采用低常采用低压梯度梯度:一台高一台高压泵,通通过比例比例调节阀,将两种或将两种或多种不同极性的溶多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高按一定的比例抽入高压泵中混合。中混合。或者：或者：利用两台高利用两台高压输液液泵，将两种不同极，将两种不同极性的溶性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混按一定的比例送入梯度混合室，混合后合后进入色入色谱柱。柱。(5)进样器器高压进样阀用微量注射器将样品注入样品环管（10L到2mL）(6)色色谱柱柱色谱系统的心脏优质不锈钢管，内壁光洁平滑接头死体积尽可能小为了保护色谱柱不被污染，有时候需要在分析柱前加一根短柱，称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加压力，在卫柱中使用的颗粒大小约1030 m。柱体柱体为直型不直型不锈钢管，内径管，内径16 mm，柱柱长540 cm。发展展趋势是是减小填料粒减小填料粒度和柱径度和柱径以提高柱效。以提高柱效。(7)检测器器紫外紫外检测器器 70应用，氘灯，适用于梯度淋洗 对流动相速度变化不敏感 溶剂选择时紫外检测器波长不能小于溶剂的紫外截至波长；紫外检测器的重要进展：光光电二二极极管管阵列列检测器器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。荧光光检测器器灵敏度比紫外高2个数量级 高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；示差折光示差折光检测器器 通用型，灵敏度低，温度影响大，不能用于梯度淋洗；偏转式、反射式和干涉型三种；电化学化学检测器器 电导检测器、库仑检测器、伏安检测器以及安培检测器。电导检测器只用于离子色谱。安培型最常用，灵敏度高，选择性好。紫外吸收紫外吸收 示差折光示差折光荧光荧光安培安培类型类型选择性选择性通用性通用性选择性选择性选择性选择性线性范围线性范围2.4 104104103104最小检测量最小检测量ng0.11102 10310-3 10-20.011梯度淋洗梯度淋洗能能不能不能能能不能不能流速敏感性流速敏感性不敏感不敏感不敏感不敏感不敏感不敏感敏感敏感温度敏感性温度敏感性低低敏感敏感低低敏感敏感HPLC检测器性能比器性能比较3 液液-固色谱法固色谱法（1）原理）原理 吸附能力大小 与吸附剂比表面积、物理化学性质、组分分子结构、流动相性质有关。组分、溶剂竞争吸附活性中心 分离非离子型、不溶于水的几何异构体几何异构体 非极性石油烃的组成分析、芳香异构体等（2）固定相）固定相 常用的是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。一般采用5-10m全多孔微粒。（3）流）流动相相 极性大的组分选择极性强的流动相，极性小的选择极性弱的流动相。对于给定的吸附剂，溶剂强度用溶剂强度参数表示，即单位面积吸附剂表面的溶剂吸附能。越大，溶剂极性越大。保留值主要取决于官能团类型和数目。各类物质的保留值顺序：饱和和烃烯烃芳芳烃 有有机机卤化化物物硫硫化化物物醚硝硝基基化化合合物物腈酯 醛 酮醇醇 胺胺酰胺胺羧酸酸磺酸磺酸4 化学键合相色谱法化学键合相色谱法（1）化学）化学键合相合相 硅胶表面的硅羟基，能与合适的化合物反应。1）消除或者掩盖了表面吸附活性点，使表面性质均匀，缓和不可逆吸附，提高峰对称性。2）耐溶剂冲洗，没有固定液流失。3）改变键合的有机分子的结构和官能团类型，能改变固定相的分离选择性。4）固定液稳定性高，配用高灵敏度检测器，可以降低最低检出量。键合反应类型：键合反应类型：1.Si-O-C键型（硅胶和醇类的反应）发发展展初初期期使使用用的的，在在有有水水、醇醇存存在在下下，有有水水解解和和醇醇解解的的可可能能，只只能能在在正相条件下使用。正相条件下使用。2.Si-N-C、Si-C键型（卤化硅胶和胺类的反应）热和化学稳定性比酯型好。热和化学稳定性比酯型好。从从理理论论上上讲讲，这这种种结结构构具具有有更更好好的的稳稳定定性性，特特别别是是对对于于微微碱碱性性流流动动相相，而而且且R基基可可以以多多次次氯化，形成聚烷基键合相，但是制备困难。氯化，形成聚烷基键合相，但是制备困难。3.Si-O-Si-C键型（硅胶和有机硅烷的反应）目目前前用用得得最最多多的的类类型型。具具有有良良好好的的热热合合化学稳定性，能够在的介质中使用。化学稳定性，能够在的介质中使用。（2）正相）正相键合相色合相色谱 流动相极性小于固定相，常常是混合溶剂，由非极性溶剂与极性溶剂混合而成，极性增大，保留值降低。适合于分离中等极性的化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。影响反相键合相色谱保留值的因素：影响反相键合相色谱保留值的因素：碳链长度。碳的负载量和表面覆盖率。载体孔径尺寸与纯度残余硅醇基数目（3）反相）反相键合相色合相色谱 C18和C8最常用，流动相为极性溶剂。极性大的组分先流出，极性小的后流出。反相色谱流动相反相色谱流动相 水和与水混溶的有机溶剂混合组成。溶剂强度可以调节，极性越大，洗脱能力越小。反相色谱受到最广泛应用的原因：反相色谱受到最广泛应用的原因：u在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH和极性等，以提高选择性。u而且水的截止波长低，有利于痕量组分的检测。u反相键合相稳定，不易被强极性组分污染。u利用二次化学平衡，可以使不能直接用反相色谱分离的组分用反相色谱分离。反相色谱中的离子抑制法反相色谱中的离子抑制法 分离水溶液中可解离的弱酸弱碱时，通过调节流动相的pH来抑制解离，使分离改进的方法。流动相的pH应调节至比组分的pKa大（碱）或小（酸）两个单位以上。当弱酸的pKa在3 pKa 7之间、弱碱的pKa在7 pKa 8之间可采用离子抑制法。对于pKa 8的碱，可以采取离子对色谱法。离子对色谱离子对色谱 离子对提取技术与色谱的结合。强极性电离型化合物在反相色谱体系中保留值很低，接近死时间流出来，直接用RP-HPLC分离困难。而离子交换色谱不能够同时分离离子型和非离子型样品，而且柱效不高。为了分离离子性化合物，Schill等将离子对萃取原理引入高效液相色谱，形成离子对色谱，又称为离子对分配色谱。它是在色谱体系中加入一种与样品离子电荷相反的离子对试剂，通常称为对离子（counterion）。由于形成离子对、动态离子交换或者离子相互作用等第二种化学平衡，从而改变了样品离子在两相中的分配，使离子性溶质保留行为和分离选择性发生显著变化。色谱系统中有机溶剂通过溶剂化使亲脂性离子对稳定性提高：影响离子对色谱保留值的因素：影响离子对色谱保留值的因素：upH。u离子对试剂的性质和浓度。u溶剂化作用。u离子强度和金属离子影响。随着离子强度的增加，离子对的保留值下降，而中性溶质的保留值趋于上升。u温度。5 离子交换色谱法离子交换色谱法（1）原理）原理 离子交换色谱通过固定相表面带电荷的基团与样品离子以及流动相离子进行可逆交换、离子-偶极作用或吸附，实现色谱分离。不同组分离子对固定离子基团亲和力差别实现分离。柠 檬 酸 根 SO42-C2O42-I-HSO4-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F-Fe3+Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+UO22+Tl+Ag+Cs+Rb+K+NH4+H+Li+（2）固定相）固定相 通常称为离子交换剂或者离子交换填料。根据交换剂的性质，有用于交换阳离子的阳离子交换剂和交换阴离子的阴离子交换剂。根据交换基团不同，分为强酸性阳离子、弱酸性阳离子、强碱性阴离子、弱碱性阴离子。离子交离子交换树脂脂 应用最广泛的离子交换树脂是苯乙烯型，它是在苯乙烯树脂上引入离子交换基团。硅胶化学硅胶化学键合离子交合离子交换剂 为了克服离子交换剂树脂溶涨和被压缩的缺点，制备了各种硅胶键合离子交换剂。（3）流）流动相相 盐类缓冲溶液，影响保留值的因素：pH 缓冲剂类型（淋洗离子电荷）离子强度 有机溶剂添加剂 配位剂：配体交换反应 RM-L+X RM-X+L（4）离子色）离子色谱法法 电导检测器是离子交换色谱常用的检测器，然而，离子交换色谱淋洗液很多是强电解质，其电导比待测溶质高两个数量级，完全掩盖了待测离子信号。大多数无机离子没有紫外吸收，检测困难是妨碍离子交换色谱发展和应用的重要原因之一。1975年，Small等提出的离子色谱很好解决了这个问题。双柱离子色双柱离子色谱（抑制离子色（抑制离子色谱）分离柱采用低容量交换剂，交换柱上分离机理和离子交换色谱相同。抑制柱反应是构成离子色谱高灵敏度个高选择性的重要基础。分离阳离子，一般用无机酸做淋洗剂，强碱性高容量阴离子交换剂做抑制柱，在抑制柱内产生两个重要反应：R+OH-+H+Cl-R+Cl-+H2OR+OH-+M+Cl-R+Cl-+M+OH-流动相的无机酸与抑制柱反应生成水而除去，待测阳离子由盐转变成相应的碱。抑制反应的结果不仅降低了淋洗液电导，而且由于OH-的离子淌度是Cl-的倍，同时提高了检测阳离子的灵敏度。分离阴离子，一般用NaOH或者NaHCO3做淋洗剂，强酸性高容量阳离子交换剂做抑制柱，在抑制柱内产生两个重要反应：R-H+Na+OH-R-Na+H2OR-H+Na+X-R-Na+H+X-淋洗液在抑制柱上反应，淋洗离子变成水或者碳酸（NaHCO3时），使本底电导大大降低。样品离子转变成相应的酸，而且由于H+的离子淌度是Na+的7倍，同时提高了检测阴离子的灵敏度。由于抑制柱积累了来自流动相的Na+或Cl-离子，逐渐丧失抑制能力，必须经常用酸或碱再生。膜离子抑制器膜离子抑制器 抑制柱必须再生，寿命短。为了克服这个缺点，采用具有磺酸基或季胺基团的聚苯乙烯多孔纤维制成的离子交换膜管，管内流过洗脱液，管外流过离子交换再生液。6 尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法（1）原理）原理 按照分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称为凝胶色谱法。以水溶液为流动相称凝胶过滤色谱（GFC），有机溶剂为流动相称为凝胶渗透色谱（GPC）。VsVGVm凝胶色凝胶色谱柱床的体柱床的体积分布分布 凝胶色谱柱床总体积VA包括填料骨架体积VG，填料孔穴体积VS和颗粒间体积Vm：VA=VG+VS+VmVT=VS+Vm固定相固定相凝胶色谱填料孔穴中VS的溶剂流流动相相填料颗粒间的体积Vm 中的溶剂 溶剂分子能够扩散进入填料孔穴。如果溶质分子足够小，也可以不同程度地向孔穴内扩散，占据一部分孔穴体积；如果溶质分子体积足够大，则不能扩散进入孔穴，被最先流出。Ve=Vm+VSa式中Ve是淋洗体积，即溶质保留体积，VSa是一定分子大小的溶质渗进孔穴所占的体积，是VS的一部分，是溶质分子量的函数。VSa和VS之比定义为分配系数KGPC：相相对分子量校准曲分子量校准曲线 以相对分子量对保留体积作图。A 排除极限排除极限B 全渗透极限全渗透极限（2）固定相）固定相 常用的有无机和有机两类，5-10m。多孔玻璃或硅胶：多孔玻璃或硅胶：平衡快，耐高温，制造容易，孔径4-250nm。易产生吸附效应，需硅烷化处理。苯乙苯乙烯二乙二乙烯基苯共聚物：基苯共聚物：孔径由交联剂二乙烯基苯的量来控制，疏水性，流动相必须是非水溶剂。在交联剂中引入亲水基团，如磺化二乙烯基苯等，可以得到亲水的共聚物。孔径大小孔径大小是非常重要的参数，它表明可分离的相对分子量的范围。（3）流）流动相相 要要求求：能溶解样品，沸点比柱温高25-50C，粘度低，与样品折光率相差大。常用四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺、水等。尺寸排阻色尺寸排阻色谱主要主要应用：用：分离蛋白质、核酸等 测定高聚物的相对分子量分布 研究聚合机理7 分离模式选择与应用分离模式选择与应用 从分子量、水溶性、极性和分子分子量、水溶性、极性和分子结构构出发进行选择。样样品品分子量2000水溶性非水溶性离子型离子交换色谱离子交换色谱非离子型或可形成离子对腈基或氨基正相键合相色谱腈基或氨基正相键合相色谱溶于非极性或弱极性溶剂（极性在CHCl3以下）溶于中等极性或极性溶剂（极性在CHCl3以上）C4、C8、C18及及苯苯基基反反相键合相色谱相键合相色谱腈基或氨基正相键合相色谱腈基或氨基正相键合相色谱硅胶吸附色谱硅胶吸附色谱水溶性非水溶性离子型离子交换色谱离子交换色谱非离子型或可形成离子对C4、C8、C18反相键合相色谱反相键合相色谱尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱分子尺寸30nm分子尺寸30400nmC4、C8、C18反相键合相色谱反相键合相色谱尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱溶于溶于CHCl3溶于醇、溶于醇、乙酸乙酯乙酸乙酯分子尺寸分子尺寸30nm分子尺寸分子尺寸30400nm 8 超临界流体色谱法超临界流体色谱法（1）原理）原理 以超临界流体为流动相的色谱方法。纯纯物物质质的的相相图图压力力增增大大，流流动相相密密度度增增加加，溶溶剂力力增增大大，保保留留值降低降低特点：特点：结合气相色谱和液相色谱的优点，弥补它们的不足。1.可以分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发性样品2.比液相色谱具有更快的分析速度和更高的柱效率。3.可以选用气相色谱、液相色谱用的检测器，与质谱、傅立叶变换红外光谱等在线联用也较方便4.复杂样品分析可以采取程序升密度的方式。（2）仪器器 与气相色谱仪和高效液相色谱仪类似，但有以下不同：SFC整个色谱仪体系都处在高压夏，必须有程序升压的精密控制设备。控温系统类似于GC，但更加精密。柱出口流体以气体形式释放，一般进入FID，因此，柱后必须装毛细管限流器，实现限流器两端的相的瞬间转变。毛细管限流器一般长约2-10cm、内径5-10m。由于限流器两端的相转变过程属于吸热过程，为防止高沸点组分冷凝，限流器温度保持在约300-400C。（2）固定相）固定相1.要求耐溶要求耐溶剂冲洗。冲洗。对于细内径毛细管柱，主要是交联柱。对于微粒填充柱，主要是硅胶为基质的化学键合相。2.多使用厚液膜柱（）。多使用厚液膜柱（）。液膜厚度主要受样品挥发性和检测器灵敏度的限制，厚液膜柱的柱子容量大，与各种检测器匹配好。常用的固定相有甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷、聚乙二醇，以及聚酰胺等。（3）流）流动相相 CO2弱弱极极性性流流动相相：临界温度Tc=31.1,临界压力为。在40Mpa时即可达到高密度，从而有较大的溶解能力。它容易纯化、价廉、无毒、不燃烧、不爆炸，与不同的检测方法匹配的性能也较好，是理想的弱极性流动相。其他弱极性流动相还有烃类、氟氯烃、六氟化硫、氙气、氧化亚氮等。NH3极性流极性流动相相：溶剂力强，对固定相要求十分苛刻。CO2改改性性流流动相相：在CO2中添加改性剂，改变CO2流体的极性、提高对极性溶质的溶解度、对柱子去活。常用的改性剂是甲醇、其次是脂肪醇类，以及苯类等。（4）检测器器 氢火焰离子化火焰离子化检测器器：CO2不响应，广泛使用。紫外紫外检测器器：CO2的紫外辐射透过性好，常用 质谱、傅立叶、傅立叶变换红外外检测器等。器等。（5）应用用 作为GC和HPLC的补充，用于热不稳定、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性化合物的分离分析。例如十五聚葡萄糖，经过三甲基硅烷化衍生后，相对分子量提高到5832，不仅在SFC条件下得到分离，而且和质谱联用得到定性鉴别。昆虫的蜕皮类固醇，GC易分解，HPLC紫外检测灵敏度不够。SFCFIDHu曲线如下图，解释原因。uHHPLCSFC