实验四小麦萌发前后淀粉酶活力的比较.ppt

College of Life SciencesHubei Normal University小麦萌发前后淀粉酶活力的比较小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 College of Life SciencesHubei Normal University实验目的实验目的 1 熟悉分光光度计的原理和使用方法；熟悉分光光度计的原理和使用方法；2 学习测定淀粉酶活力的方法；学习测定淀粉酶活力的方法；3 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。College of Life SciencesHubei Normal University实验原理实验原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。分解为麦芽糖。2（C6H10O5）n+nH2OnC12H12O11 麦麦芽芽糖糖有有还还原原性性，能能使使3，5二二硝硝基基水水杨杨酸酸还还原原成成棕棕色色的的3氨氨基基5硝硝基基水水杨杨酸酸，后后者者可可用用分分光光光光度度法法测测定定。在在一一定定范范围围内内，还还原原糖糖的的量量与与棕棕红红色色物物质质颜颜色色的的深深浅浅成成正正比比关关系系，利利用用分分光光光光度度计在计在540 nm 波长下测定吸光值，便可求出样品中还原糖的量波长下测定吸光值，便可求出样品中还原糖的量College of Life SciencesHubei Normal UniversityCollege of Life SciencesHubei Normal University 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。萌发和出苗 germination vs.emergencyCollege of Life SciencesHubei Normal University实验材料实验材料 1 器材：移液管器材：移液管 乳钵乳钵 离心机离心机 水浴锅水浴锅 分光光度计分光光度计 2 试剂和材料：试剂和材料：小麦种子，小麦种子，标准麦芽糖溶液，标准麦芽糖溶液，磷酸缓冲液，淀粉溶液磷酸缓冲液，淀粉溶液 3，5-二硝基水杨酸，二硝基水杨酸，氯化钠氯化钠College of Life SciencesHubei Normal University操作步骤1.种子发芽种子发芽 小麦种子浸泡小时后，放入小麦种子浸泡小时后，放入25 恒温箱内或在室温下发芽。恒温箱内或在室温下发芽。（一般在光照培养箱内，（一般在光照培养箱内，2-3天后开始萌发）天后开始萌发）2.酶液提取酶液提取 取发芽第取发芽第3或第或第4天的幼苗天的幼苗15株，放入乳钵内，加株，放入乳钵内，加1%氯化钠氯化钠溶液溶液10 mL,用力磨碎。在室温下放置用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后分钟，搅拌几次。然后将提取液离心将提取液离心67分钟（分钟（1500 r/min）。将上清夜倒入量筒，测）。将上清夜倒入量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将酶提取液定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将酶提取液稀释稀释10倍（倍（1 mL 酶提取液酶提取液+9 mL缓冲液）。缓冲液）。取干燥种子或浸泡小时后的种子取干燥种子或浸泡小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同粒作为对照（提取步骤同上）上）。College of Life SciencesHubei Normal University 3.3.酶活力测定酶活力测定（1 1）取）取25 mL25 mL刻度试管刻度试管4 4支，编号。支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在按下表要求加入各试剂（各试剂须在2525预热预热1010分钟）分钟）。试试管管号号试剂试剂1 12 23 34 4干燥种子（或浸泡干燥种子（或浸泡2.52.5小小时时后）的后）的酶酶提取液提取液发发芽芽3 3或或4 4天天幼苗的幼苗的酶酶提提取液取液标标准管准管空白管空白管酶酶液（液（mLmL）0.50.50.50.5-标标准麦芽糖溶液准麦芽糖溶液（mLmL）-0.50.5-1%1%淀粉溶液（淀粉溶液（mLmL）1 11 11 11 1水（水（mLmL）-0.50.5College of Life SciencesHubei Normal University 将各管混匀，放在将各管混匀，放在2525水浴中，保温水浴中，保温3 3分钟后，立即向各管中分钟后，立即向各管中加入加入1%31%3，5 5二硝基水杨酸溶液二硝基水杨酸溶液2 mL 2 mL。（2 2）取出各试管，放入沸水浴中加热）取出各试管，放入沸水浴中加热5 5分钟。冷至室温，加水稀分钟。冷至室温，加水稀释至释至25 mL25 mL。将各管充分混匀。将各管充分混匀。（3 3）用空白管作对照：在）用空白管作对照：在A A540 nm540 nm处测定各管的光吸收值，将读数处测定各管的光吸收值，将读数填入下表。填入下表。试试管号管号1.干燥种干燥种子的子的酶酶提提取液取液2.发发芽芽3、4天幼苗的天幼苗的酶酶提取液提取液3.标标准准4.空白空白光吸收光吸收值值（A540 nm）College of Life SciencesHubei Normal University 4.4.计算计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A A标准标准 C C标准标准 A A未知未知 C C未知未知 则：则：c c（酶液管中麦芽糖的浓度）（酶液管中麦芽糖的浓度）=A=A酶酶CC标准标准A A标准标准 式中：式中：c c为浓度；为浓度；A A为光吸收值。为光吸收值。College of Life SciencesHubei Normal University 本实验规定：本实验规定：2525时时3 3分钟内水解淀粉释放分钟内水解淀粉释放1 mg1 mg麦芽糖所需麦芽糖所需的酶量为的酶量为1 1个活力单位。个活力单位。则则1515粒种子或粒种子或1515株幼苗的总活力单位为：株幼苗的总活力单位为：总活力单位总活力单位=c=c酶酶nn酶酶VV酶酶 式中：式中：c c酶酶为酶液中麦芽糖的浓度；为酶液中麦芽糖的浓度；n n酶酶为酶液稀释倍数；为酶液稀释倍数；V V酶酶为提取酶液的总体积。为提取酶液的总体积。College of Life SciencesHubei Normal University思考题思考题1 提纯酶的过程需要注意什么问题？提纯酶的过程需要注意什么问题？2 为什么测定酶活力时要保温为什么测定酶活力时要保温3分钟？反应后又放入到分钟？反应后又放入到沸水浴？沸水浴？3 研磨时加研磨时加加加1%氯化钠溶液的作用（离子强度和渗透压）。氯化钠溶液的作用（离子强度和渗透压）。College of Life SciencesHubei Normal University谢谢 谢谢