工业微生物代谢控制育种.ppt

第八章第八章 工工业微生物代微生物代谢控制育种控制育种主要内容：主要内容：概概论初初级代代谢的的调节控制控制次次级代代谢的的调节控制控制代代谢控制育种控制育种代代谢控制控制发酵大体酵大体过程如下：程如下：以生物化学和以生物化学和遗传学学为基基础，研究代，研究代谢产物的生物合成途物的生物合成途径和代径和代谢调节的机制的机制选择巧妙的技巧妙的技术路路线，通，通过遗传育育种技种技术获得解除或得解除或绕过了微生物正常代了微生物正常代谢途径的突途径的突变株株从而人从而人为地使有用地使有用产物物选择性地大量合成和累性地大量合成和累积。代代谢控制控制发酵的关酵的关键：取决于微生物代取决于微生物代谢调控机制是否能控机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人，人为地控制微生地控制微生物的代物的代谢。实现代代谢控制目控制目标的手段：的手段：代代谢控制育种和控制育种和发酵酵过程的程的代代谢控制培养，而代控制培养，而代谢控制育种控制育种则为主要支柱技主要支柱技术。微生物菌体微生物菌体积累的累的发酵酵产物主要有物主要有酶代代谢产物物（酒精、甘油、乳酸、丙酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇、有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白丁醇、有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白质、抗生素、抗生素、维生素、脂肪、多生素、脂肪、多糖等）糖等）这些些产物中有些是某种微生物在一定的物中有些是某种微生物在一定的环境条件下生境条件下生成的，如酒精、乳酸等；也有成的，如酒精、乳酸等；也有许多多产物是生理正常的微生物是生理正常的微生物不能物不能过量量积累的，必累的，必须是具有特异生理特征的微生物才是具有特异生理特征的微生物才能能积累。人累。人为地改地改变微生物的代微生物的代谢调控机制，使有用的中控机制，使有用的中间代代谢产物物过量量积累，累，这种种发酵称酵称为代代谢控制控制发酵。酵。考察工考察工业微生物微生物发展史，展史，可以看到可以看到经典的典的诱变育种具有育种具有一定盲目性，而代一定盲目性，而代谢控制育种将微生物控制育种将微生物遗传学的理学的理论与育与育种种实践密切践密切结合，先研究目的合，先研究目的产物的生物合成途径、物的生物合成途径、遗传控制及代控制及代谢调节机制，然后机制，然后进行定向控制育种。行定向控制育种。代代谢控制控制发酵的出酵的出现与与发展，与以下几方面是密不可分的：展，与以下几方面是密不可分的：生物化学的生物化学的发展，确立了代展，确立了代谢图谱，同，同时发现了代了代谢过程程中的各种中的各种调节机制；分子生物学和分子机制；分子生物学和分子遗传学的学的发展，可展，可以人以人为地在地在DNA分子水平上改分子水平上改变微生物的代微生物的代谢，多方面利，多方面利用微生物的代用微生物的代谢活性；合理控制活性；合理控制环境，采用境，采用过程控制方法，程控制方法，对发酵酵过程程进行最行最优化控制，使目的化控制，使目的产物大量物大量积累。累。第一节概论一、初一、初级代代谢产物和初物和初级代代谢初初级代代谢产物物微生物微生物产生的生的对自身生自身生长和繁殖必和繁殖必须的物的物质初初级代代谢产生生这些物些物质的代的代谢系称系称为初初级代代谢。初初级代代谢体系体系分解代分解代谢体系：体系：包括糖、脂、蛋白包括糖、脂、蛋白质等物等物质的降的降解，解，获取能量取能量素材性生物合成体系：素材性生物合成体系：合成某些小分子材料合成某些小分子材料结构性生物合成体系：构性生物合成体系：用小分子合成用小分子合成产物装配大物装配大分子。分子。二、次二、次级代代谢产物和次物和次级代代谢根据根据Demain的定的定义：“次次级代代谢产物是物是对产生生它它们的生物体本身不需要的一种的生物体本身不需要的一种产物物”。这些物些物质有抗生素、生有抗生素、生长刺激素、生物碱、色刺激素、生物碱、色素、毒素以及甾体等。素、毒素以及甾体等。通常把以初通常把以初级代代谢产物物为前体，合成次生前体，合成次生产物物的代的代谢体系称体系称为次次级代代谢。三、初三、初级代代谢与次与次级代代谢的关系的关系1.菌体代菌体代谢方面方面 抗生素是微生物的次抗生素是微生物的次级代代谢产物中的一大物中的一大类。微生物。微生物的初的初级代代谢与次与次级代代谢既有区既有区别，又有，又有联系。系。许多抗生素的基本多抗生素的基本结构是由少数几种初构是由少数几种初级代代谢产物物构成的，所以次构成的，所以次级代代谢产物是以初物是以初级代代谢产物物为母体衍母体衍生出来的，次生出来的，次级代代谢途径并不是独立的，而是与初途径并不是独立的，而是与初级代代谢途径有密切关系的。途径有密切关系的。糖代糖代谢中中间体，既可用来合成初体，既可用来合成初级代代谢产物，又可物，又可用来合成次用来合成次级代代谢产物，物，这种中种中间体叫做体叫做分支分支(叉叉)中中间体体。分叉中间体分叉中间体初级代谢产物初级代谢产物次级代谢产物次级代谢产物-氨基己二糖氨基己二糖丙二酰丙二酰CoACoA乙酰乙酰CoACoA赖氨酸赖氨酸脂肪酸脂肪酸青霉素、头孢菌素青霉素、头孢菌素利福霉素族、四环素族利福霉素族、四环素族大环内酯族、多烯族抗生素、灰大环内酯族、多烯族抗生素、灰黄霉素、橘霉素、环己酰亚胺、黄霉素、橘霉素、环己酰亚胺、棒曲霉素棒曲霉素莽草酸莽草酸对氨基苯丙氨酸对氨基苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸、对氨基苯甲酸、酪氨酸、对氨基苯甲酸、色氨酸色氨酸氯霉素氯霉素绿脓菌素绿脓菌素新生霉素新生霉素 次次级代代谢产物的合成，至少有一部分取决于与物的合成，至少有一部分取决于与初初级代代谢产物无关的物无关的遗传物物质，并和由，并和由这类遗传物物质形成的形成的酶所催化的代所催化的代谢途径有关，它途径有关，它们多数是特多数是特异菌株。从代异菌株。从代谢途径来看，次途径来看，次级代代谢产物是以初物是以初级代代谢产物物为前体衍生出来的，前体衍生出来的，见下下图。脂肪酸脂肪酸（nC3、nC2）葡萄糖葡萄糖（C6）丙糖丙糖P丙丙酮酸酸（C3）（C3）乙乙酰CoA（C2）柠檬酸檬酸（C6）草草酰乙酸乙酸-酮戊二酸戊二酸（C5）CO2CO2谷氨酸谷氨酸（C5N）次次级代代谢产物物戊糖戊糖（C5）氨基糖苷氨基糖苷类抗生素抗生素糖苷糖苷类多糖多糖核苷核苷核苷核苷类抗生素抗生素丝氨酸氨酸（C3N）甘氨酸甘氨酸（C2N）半胱氨酸半胱氨酸次次级代代谢物物丁糖丁糖（C4）莽草酸莽草酸（C7）芳香族氨基酸芳香族氨基酸次次级代代谢产物物芳香族次芳香族次级代代谢产物物缬氨酸氨酸（C5N）生物甲基化生物甲基化次次级代代谢产物物C1丙氨酸丙氨酸（C3N）甲甲羟戊酸戊酸（C3）焦磷酸异戊焦磷酸异戊酯（C3）CO2萜甾体甾体甾体甾体（6C5）丙二酸丙二酸（C3）CO2CO2CO2聚聚酮体体次次级代代谢产物物天冬氨酸天冬氨酸（C4N）（nC2）葡萄糖分解代葡萄糖分解代谢的主要途径的主要途径初初级代代谢的合成的合成过程程图从碳代从碳代谢流看初流看初级代代谢与次与次级代代谢 由初由初级代代谢产物衍生的次物衍生的次级代代谢产物的生物合成途物的生物合成途径有七种。在径有七种。在这些次些次级代代谢途径中所涉及的途径中所涉及的酶有的是初有的是初级代代谢酶，有的是次，有的是次级代代谢所特有的所特有的酶。初。初级代代谢与次与次级代代谢都受菌体的代都受菌体的代谢调节，在，在调节控制上是相互影响的，当控制上是相互影响的，当与抗生素合成有关的初与抗生素合成有关的初级代代谢途径受到控制途径受到控制时，抗生素的，抗生素的生物合成必然受阻。生物合成必然受阻。葡萄糖碳架参入途径葡萄糖碳架参入途径 莽草酸途径莽草酸途径 与核苷有关的途径与核苷有关的途径 聚聚酮糖和聚丙酸途径糖和聚丙酸途径 由氨基酸衍生的途径由氨基酸衍生的途径 甲甲羟戊酸途径戊酸途径 其他复合途径其他复合途径综上所述，在代上所述，在代谢途径、途径、酶系关系以及系关系以及调控上，控上，次次级代代谢与初与初级代代谢都都有着密切关系。因此，有着密切关系。因此，在研究次在研究次级代代谢时，必，必须与初与初级代代谢联系起来系起来考考虑。2.2.遗传代代谢方面方面初初级代代谢与次与次级代代谢同同样都受到核内都受到核内DNADNA的的调节控制控制,而次而次级代代谢产物物还受到与初受到与初级代代谢产物合成无关的物合成无关的遗传物物质的控制的控制,即受核内即受核内遗传物物质(染色体染色体遗传物物质)和核外和核外遗传物物质(质粒粒)的控制的控制.有一部分代有一部分代谢产物的形成，取决物的形成，取决于由于由质粒信息粒信息产生的生的酶所控制的代所控制的代谢途径，途径，这类物物质称称为质粒粒产物。物。由于由于这类物物质的形成直接或的形成直接或间接受接受质粒粒遗传物物质的控的控制，因而制，因而产生了生了质粒粒遗传的的观点。点。也有只由染色体也有只由染色体DNADNA控制的抗生素控制的抗生素产物。物。次次级代代谢产物（物（质粒粒产物）物）初初级代代谢产物（物（质粒粒产物）物）底物（底物（营养物）养物）中中间体（体（质粒粒产物）物）底物（异常底物（异常营养物）养物）酶、蛋白、蛋白质酶、蛋白、蛋白质、次、次级代代谢产物物（质粒粒产物）物）核糖核蛋白体系核糖核蛋白体系统mRNAmRNA染色体染色体质粒粒次次级代代谢产物生物合成与初物生物合成与初级代代谢产物的关系物的关系第二第二节 初初级代代谢的的调节控制控制一、一、酶合成的合成的调节通通过调节酶合成量合成量进而而调节代代谢速率，是在基因水平上速率，是在基因水平上（原核生物中（原核生物中转录水平）的代水平）的代谢调节特点：特点：间接接缓慢、慢、节约能量和原料能量和原料酶合成合成调节诱导酶合成合成阻遏阻遏酶合成合成 酶合成合成调节的的类型型诱导：当：当环境中存在境中存在诱导物（底物及物（底物及类似物、底物前体）似物、底物前体）时，促，促进酶合成，合成，诱导方式有同方式有同时诱导、顺序序诱导 阻遏：阻遏：过量代量代谢产物阻碍代物阻碍代谢途径中包括关途径中包括关键酶在内的在内的一系列一系列酶的合成，从而控制代的合成，从而控制代谢，减少末端，减少末端产物的合成物的合成 酶合成合成调节的机制的机制乳糖操乳糖操纵子的子的调节色氨酸操色氨酸操纵子的反子的反馈阻遏阻遏DNA（促（促 进）进）分解代分解代谢物阻遏的乳糖操物阻遏的乳糖操纵子模型子模型转乙乙酰基基酶调节基因基因CAP-cAMPRNApolLacZOLacYLacA阻遏蛋白阻遏蛋白启动基因启动基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合聚合酶乳糖乳糖阻遏蛋白阻遏蛋白mRNA半乳糖苷半乳糖苷酶透透过酶葡萄糖葡萄糖（阻断）（阻断）XATPcAMPCAPAMP葡萄糖分解代葡萄糖分解代谢物物X X阻止阻止CAP-cAMPCAP-cAMP的形成，从而阻止了的形成，从而阻止了RNARNA聚合聚合酶与启与启动基因上基因上结合位点合位点(RNApol.)(RNApol.)的的结合，即使有合，即使有诱导物乳糖存在，与乳糖代物乳糖存在，与乳糖代谢有关的有关的酶仍无仍无法合成法合成二、二、酶活性的活性的调节通通过改改变现成成的的酶分分子子活活性性来来调节新新陈代代谢的的速速率率的的方方式式。是是酶分分子水平上的子水平上的调节，属于精，属于精细的的调节。（一）（一）调节方式：方式：包括两个方面：包括两个方面：1、酶活活性性的的激激活活：在在代代谢途途径径中中后后面面的的反反应可可被被较前前面面的的反反应产物所促物所促进的的现象；常象；常见于分解代于分解代谢途径。途径。如：粗糙脉如：粗糙脉孢霉的异霉的异柠檬酸脱檬酸脱氢酶的活性受的活性受柠檬酸促檬酸促进2、酶活性的抑制活性的抑制：包括：包括：竞争性抑制和反争性抑制和反馈抑制。抑制。概概念念：反反馈：指指反反应链中中某某些些中中间代代谢产物物或或终产物物对该途途径径关关键酶活性的影响。活性的影响。凡使反凡使反应速度加快的称速度加快的称正反正反馈；凡使反凡使反应速度减慢的称速度减慢的称负反反馈（反（反馈抑制）抑制）；反反馈抑抑制制主主要要表表现在在某某代代谢途途径径的的末末端端产物物过量量时可可反反过来来直直接接抑抑制制该途途径径中中第第一一个个酶的的活活性性。主主要要表表现在在氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸合合成成途途径中。径中。特点：作用直接、效果快速、末端特点：作用直接、效果快速、末端产物物浓度降低度降低时又可解除又可解除1.直直线式代式代谢途径中的反途径中的反馈抑制抑制：苏氨酸脱氨氨酸脱氨酶苏氨酸氨酸-酮丁酸丁酸异亮氨酸异亮氨酸反反馈抑制抑制其它其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.2.分支代分支代谢途径中的反途径中的反馈抑制：抑制：在分支代在分支代谢途径中，反途径中，反馈抑制的情况抑制的情况较为复复杂，为了避免在了避免在一个分支上的一个分支上的产物物过多多时不致同不致同时影响另一分支上影响另一分支上产物的供物的供应，微生物，微生物发展出多种展出多种调节方式。主要有：方式。主要有：同功同功酶的的调节，顺序反序反馈，协同反同反馈，积累反累反馈调节等。等。（二）反（二）反馈抑制的抑制的类型型（1 1）同功）同功酶调节isoenzymeisoenzyme定定义：催化相同的生化反：催化相同的生化反应，而，而酶分子分子结构有差构有差别的一的一组酶。意意义：在一个分支代：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个途径中，如果在分支点以前的一个较早的反早的反应是由几个同功是由几个同功酶催化催化时，则分支代分支代谢的几个最的几个最终产物往往分物往往分别对这几个同功几个同功酶发生抑制作用。生抑制作用。某一某一产物物过量量仅抑制相抑制相应酶活性，活性，对其他其他产物没影响。物没影响。举例：大例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节（2 2）协同反同反馈抑制抑制concerted feedback inhibition定定义：分支代：分支代谢途径中几个末端途径中几个末端产物同物同时过量量时才能抑制才能抑制共同途径中的第一个共同途径中的第一个酶的一种反的一种反馈调节方式。方式。举例：谷氨酸棒杆菌（例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽多粘芽孢杆菌（杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受受赖氨酸和氨酸和苏氨酸的氨酸的协同反同反馈抑制和阻遏。抑制和阻遏。（3 3）合作反）合作反馈抑制抑制cooperativefeedbackinhibitioncooperativefeedbackinhibition定定义：两种末端：两种末端产物同物同时存在存在时，共同的反，共同的反馈抑制作用大于二抑制作用大于二者者单独作用之和。独作用之和。举例：在例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受受AMP和和GMP（和（和IMP）的合作反）的合作反馈抑制，二者共同存在抑制，二者共同存在时，可以完，可以完全抑制全抑制该酶的活性。而二者的活性。而二者单独独过量量时，分，分别抑制其活性的抑制其活性的70%和和10%。（4）积累反累反馈抑制抑制cumulative feedback inhibition定定义：每一分支途径末端：每一分支途径末端产物按一定百分比物按一定百分比单独抑制共同途独抑制共同途径中前面的径中前面的酶，所以当几种末端，所以当几种末端产物共同存在物共同存在时它它们的抑制的抑制作用是作用是积累的，各末端累的，各末端产物之物之间既无既无协同效同效应，亦无拮抗作，亦无拮抗作用。用。（5 5）顺序反序反馈抑制抑制sequentialfeedbackinhibitionsequentialfeedbackinhibition一一种种终产物物的的积累累,导致致前前一一中中间产物物的的积累累，通通过后后者者反反馈抑制合成途径关抑制合成途径关键酶的活性，使合成的活性，使合成终止。止。举例：枯草芽例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的杆菌芳香族氨基酸合成的调节（三）反（三）反馈抑制的机制抑制的机制 尽管反尽管反馈抑制的抑制的类型很多，但其主要的作用方式在于末端型很多，但其主要的作用方式在于末端产物物对反反应途径中途径中调节酶的抑制。的抑制。受反受反馈抑制的抑制的调节酶一般都是一般都是变构构酶，酶活力活力调控的控的实质就是就是变构构酶的的变构构调节。变构构酶的的酶蛋白分子一般都是由两个以上蛋白分子一般都是由两个以上亚基基组成的多聚成的多聚体，具有四体，具有四级结构，构，这是能是能够产生生变构作用的物构作用的物质基基础。变构构酶分子具有两个分子具有两个结合位点，一个是与底物合位点，一个是与底物结合的催化合的催化中心（活性中心），另一个可与中心（活性中心），另一个可与调节因子（又称效因子（又称效应物）相物）相结合的合的调节中心（中心（变构中心）。构中心）。+激激活活剂底物底物+抑抑制制剂无活性形式无活性形式活性形式活性形式活性形式活性形式无活性形式无活性形式（不能（不能结合底物）合底物）底物底物图 变构构酶的激活和的激活和变构构酶的抑制的抑制 变构效构效应：当效：当效应物与物与调节中心中心结合后，可引起合后，可引起酶蛋白分蛋白分子子发生构象生构象变化，从而引起化，从而引起酶的活性中心的活性中心对底物的底物的亲和力和催和力和催化能力的改化能力的改变，激活或阻碍了，激活或阻碍了酶和它的底物的和它的底物的结合，促合，促进或抑或抑制了制了酶活力，使整个代活力，使整个代谢途径的快慢受到途径的快慢受到调节。27 突变前突变前 突变后突变后 反馈抑制与抗反馈抑制突变反馈抑制与抗反馈抑制突变效效应物物底物底物三、反三、反馈阻遏与反阻遏与反馈抑制的比抑制的比较 类型类型项目项目反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制调控对象调控对象调控开关调控开关调控的水平调控的水平调控方式调控方式调控动作调控动作形成的控制形成的控制调控反应速调控反应速度度酶的合成酶的合成终产物浓度终产物浓度DNAmRNA酶蛋白（转录水平）酶蛋白（转录水平）终产物与阻遏蛋白亲和力终产物与阻遏蛋白亲和力阻遏蛋白与操纵基因结合阻遏蛋白与操纵基因结合,不能合成不能合成mRNAmRNA开、关控制开、关控制迟缓、粗的控制迟缓、粗的控制酶的活性酶的活性终产物浓度终产物浓度酶蛋白的构象变化酶蛋白的构象变化终产物与变构部位亲和力终产物与变构部位亲和力通过变构效应通过变构效应,酶的构象变化酶的构象变化控制酶活性的大小控制酶活性的大小迅速、精确的控制迅速、精确的控制第三第三节次次级代代谢的的调节控制控制 1.1.细胞生胞生长期到抗生素期到抗生素产生期的生期的过渡渡在在细胞生胞生长期，期，负责次次级代代谢产物合成的物合成的酶处于抑制于抑制或阻遏状或阻遏状态，进入入稳定期，定期，这些些酶便开始被激活或被合便开始被激活或被合成（解除阻遏作用的原因是多方面的）。成（解除阻遏作用的原因是多方面的）。(1)(1)一种一种诱导因子在生因子在生长期末期末积累或从外源加入以解除生累或从外源加入以解除生产期的期的阻遏作用。阻遏作用。(2)(2)初初级代代谢的的终产物物对次次级代代谢途径的反途径的反馈阻遏作用，当阻遏作用，当终产物耗尽后，受阻遏的基因就被解除阻遏。物耗尽后，受阻遏的基因就被解除阻遏。(3)(3)在一种易被利用的糖源中生在一种易被利用的糖源中生长，其分解代，其分解代谢物物对抗生素合成抗生素合成有阻遏作用，当有阻遏作用，当这些阻遏些阻遏剂被利用后，便解除了阻遏作用。被利用后，便解除了阻遏作用。2.2.酶的的诱导作用作用在在细胞胞营养期一般不出养期一般不出现催化次催化次级代代谢的的酶，在，在稳定定期期发生了次生了次级代代谢酶的的诱导或解阻遏而生成。如色氨酸或解阻遏而生成。如色氨酸（或其（或其类似物）刺激麦角菌似物）刺激麦角菌诱导合成麦角灵生物碱；蛋氨合成麦角灵生物碱；蛋氨酸刺激酸刺激顶头孢霉生物合成霉生物合成头孢菌素菌素C C。(4)(4)抗生素合成途径受高能化合物的阻遏，当抗生素合成途径受高能化合物的阻遏，当ATPATP形成减少后，阻遏形成减少后，阻遏作用随即解除。作用随即解除。(5)(5)在生在生长期，期，RNARNA聚合聚合酶只能启只能启动生生长期基因的期基因的转录作用，它不能作用，它不能附着在生附着在生产期操期操纵的促的促进子的位置上，子的位置上，结果次果次级代代谢途径的途径的酶合成合成受阻遏；当生受阻遏；当生长停止后，停止后，酶的的结构改构改变，允，允许RNARNA聚合聚合酶启启动生生产期期基因的基因的转录作用，作用，负责抗生素合成的抗生素合成的酶开始生成。开始生成。3.3.分解代分解代谢产物的物的调节控制控制葡萄糖效葡萄糖效应（分解（分解产物阻遏）：在含有葡萄糖和物阻遏）：在含有葡萄糖和第二种碳源的培养基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生第二种碳源的培养基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成，只有在葡萄糖耗尽素的生物合成，只有在葡萄糖耗尽时，利用第二种碳源，利用第二种碳源（如半乳糖）所需的（如半乳糖）所需的酶开始合成，并解除开始合成，并解除对抗生素生物抗生素生物合成的抑制。此外，甘露糖、甘油也呈合成的抑制。此外，甘露糖、甘油也呈现明明显的阻遏作的阻遏作用。用。4.4.磷酸磷酸盐的的调节高高浓度磷酸度磷酸盐对许多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高浓度磷酸度磷酸盐只只长菌体而不合成抗生素；但磷酸菌体而不合成抗生素；但磷酸盐太少太少时，菌，菌体生体生长不不够，也不利于合成抗生素。因此，也不利于合成抗生素。因此，发酵工酵工艺上要上要严格控制格控制“亚适量适量”的磷酸的磷酸盐浓度。度。5.NH45.NH4的抑制作用的抑制作用在抗生素在抗生素发酵中，供酵中，供给高高浓度的容易被利用的无机氨度的容易被利用的无机氨态氮氮或其他迅速被利用的氮源，由于它或其他迅速被利用的氮源，由于它们促促进生生长，而，而强烈抑制烈抑制抗生素的合成。抗生素的合成。6.6.初初级代代谢调节对次次级代代谢的作用的作用许多次多次级代代谢产物来自初物来自初级代代谢的关的关键中中间体，因此体，因此次次级代代谢也就受初也就受初级代代谢调节的影响。的影响。7.7.次次级代代谢的反的反馈抑制（或阻遏）抑制（或阻遏）许多抗生素能阻止自身的合成。多抗生素能阻止自身的合成。8.8.次次级代代谢的能荷的能荷调节能荷能荷调节机制机制对次次级代代谢途径的控制也是有效的。途径的控制也是有效的。第四第四节 代代谢调节控制育种控制育种 从工从工业微生物育种史来看，微生物育种史来看，诱变育种曾取得了巨大的育种曾取得了巨大的成就，使微生物有效成就，使微生物有效产物成百倍、乃致成千倍的增加。物成百倍、乃致成千倍的增加。但是但是诱变育种工作量繁重，盲目性大。育种工作量繁重，盲目性大。近年来由于近年来由于应用生物化学和用生物化学和遗传学原理，深入研究了生学原理，深入研究了生物合成代物合成代谢途径以及代途径以及代谢调节控制的基控制的基础理理论：（1）可）可进行外因控制，通行外因控制，通过培养条件来解除反培养条件来解除反馈调节而使生物合成的途径朝着人而使生物合成的途径朝着人们所希望的方向所希望的方向进行，行，即即实现代代谢控制控制发酵；酵；（2）还可可进行内因改行内因改变，通，通过定向定向选育某种特定的突育某种特定的突变株，以达到大量株，以达到大量积累有益累有益产物的目的，物的目的，即所即所谓代代谢控制控制育种。育种。内因是内因是变化的根据，所以改化的根据，所以改变微生物的微生物的遗传型往往是控型往往是控制代制代谢的更的更为有效的途径。有效的途径。代代谢控制育种可以大大减少控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了育种的盲目性，提高了效率。效率。代代谢控制育种很快在初控制育种很快在初级代代谢产物的育种中得到广泛的物的育种中得到广泛的应用，成就也十分用，成就也十分显赫，赫，几乎全部氨基酸和多种核苷酸几乎全部氨基酸和多种核苷酸生生产菌株都被打上了抗性或缺陷型菌株都被打上了抗性或缺陷型遗传标记。代代谢调节控制育种通控制育种通过特定突特定突变型的型的选育，达到改育，达到改变代代谢通路、降低支路代通路、降低支路代谢终产物的物的产生或切断支路代生或切断支路代谢途途径及提高径及提高细胞膜的透性，使代胞膜的透性，使代谢流向目的流向目的产物物积累方向累方向进行。行。下表列出微生物代下表列出微生物代谢控制育种措施控制育种措施调节体系调节体系育种措施育种措施诱导诱导分解阻遏分解阻遏分解抑制分解抑制 1.1.组成型突变株的选育组成型突变株的选育2.2.抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育l解除碳源分解调节突变株的选育解除碳源分解调节突变株的选育l解除氮源分解调节突变株的选育解除氮源分解调节突变株的选育l解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制3.3.营养缺陷型突变株的选育营养缺陷型突变株的选育4.4.渗漏型缺陷型突变株的选育渗漏型缺陷型突变株的选育5.5.回复突变株的选育回复突变株的选育6.6.耐自身代谢产物的突变株的选育耐自身代谢产物的突变株的选育7.7.抗终产物结构类似物的突变株的选育抗终产物结构类似物的突变株的选育8.8.耐前体物突变株的选育耐前体物突变株的选育9.9.条件突变株的选育条件突变株的选育细胞膜渗透性细胞膜渗透性10.10.营养缺陷型突变株的选育营养缺陷型突变株的选育l生物素缺陷型生物素缺陷型l油酸缺陷型油酸缺陷型l甘油缺陷型甘油缺陷型11.11.温敏突变株温敏突变株一、一、组成型突成型突变株的株的选育育组成型突成型突变株：株：在没有在没有诱导底物存在底物存在时也能也能产生大量生大量诱导酶的突的突变株。株。筛选原理原理：通：通过诱变处理，使理，使调节基因基因发生突生突变，不，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因基因发生突生突变不再能与阻遏物相不再能与阻遏物相结合，从而使合，从而使诱导型型酶变为组成型成型酶。39 筛选方法及方法及实例：例：创造一种有利于造一种有利于组成型菌株生成型菌株生长而不利于而不利于诱导型菌株生型菌株生长的培养条件，造成的培养条件，造成对组成型突成型突变株的株的选择优势；选择适当的适当的鉴别培养基，直接在平板上培养基，直接在平板上识别两两类菌落菌落，从而把，从而把组成型突成型突变株株选择出来。出来。40 p限量限量诱导物恒化培养法物恒化培养法 控控制制低低于于诱导浓度度的的诱导物物作作碳碳源源进行行恒恒化化连续培培养养。诱导型型菌菌株株生生长极极弱弱，而而变异异株株由由于于能能产分分解解底底物物的的酶，则能能分分解解底底物物而而得得以以生生长。通通过连续不不断断加加入入新新鲜基基质，野野生生型型就就会会被被“洗洗出出”，组成成型型突突变株株就就被被不不断断“浓缩”，最最后后达达到到能能分分离的离的浓度。度。41 p循循环培养法培养法 不含不含诱导物培养基物培养基含含诱导物培养基物培养基(普通碳源或氮源）普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）物作唯一碳源或氮源）两两菌菌都都能能生生长，但但组成成型型突突变株株已已能能合合成成特定的特定的酶，亲株不能株不能变异异株株调整整期期短短，亲株株调整整期期长，短短时间培培养养后后，变异株所占比例增大异株所占比例增大 反反复复循循环培培养养几几次次后后，变异异株株所所占占比比例逐例逐渐提高，然后提高，然后进行分离行分离 p鉴别性培养基的利用性培养基的利用 将将诱变孢子子悬液液涂涂布布在在甘甘油油作作唯唯一一碳碳源源的的平板上，培养后平板上，培养后长出菌落。出菌落。然然后后在在菌菌落落上上喷上上O-硝硝基基苯苯酚酚-D-半半乳乳糖糖苷苷（ONPG），），组成型成黄色，成型成黄色，诱导型呈白色。型呈白色。原因：原因：组成型突成型突变株在没有株在没有诱导底物存在底物存在时仍能仍能产生生-半乳糖苷半乳糖苷酶，将无色，将无色试剂水解，放出水解，放出O-O-硝基苯硝基苯酚，因而很容易挑酚，因而很容易挑选。43 p筛选筛选 经诱变剂处理理后后的的菌菌体体移移接接到到含含有有诱导能能力力低低，但但能能作作为良良好好碳碳源源的的诱导物物的的培培养养基基中中培养，突培养，突变体能良好生体能良好生长，野生型不能生，野生型不能生长。例例如如：利利用用苯苯-半半乳乳糖糖（PGPG）筛选-半乳糖苷半乳糖苷酶组成型突成型突变株。株。二、二、营养缺陷型在代养缺陷型在代谢调节育种中的育种中的应用用（一）在初（一）在初级代代谢调节育种中的育种中的应用用1.在直在直线式生物合成途径中式生物合成途径中（利用利用营养缺陷型突养缺陷型突变株株进行氨基酸行氨基酸发酵必酵必须限制所要求的氨基酸量，限制所要求的氨基酸量，这样就将反就将反馈作用物作用物浓度度控制在反控制在反馈机制的机制的浓度之下度之下）谷氨酸谷氨酸N-乙乙酰-谷氨谷氨酰酰磷酸磷酸N-乙乙酰谷氨酸半谷氨酸半缩醛N-乙乙酰鸟氨酸氨酸鸟氨酸氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酸精氨酸N-乙乙酰谷氨酸谷氨酸-反馈 抑制谷氨酸棒状杆菌（瓜氨酸缺陷型）的谷氨酸棒状杆菌（瓜氨酸缺陷型）的鸟氨酸氨酸发酵代酵代谢控制机制控制机制-2.在分支式生物合成途径中在分支式生物合成途径中-协同反馈抑制天冬氨酸天冬氨酸天冬氨天冬氨酰磷酸磷酸天冬氨酸半天冬氨酸半缩酸酸醛高高丝氨酸氨酸苏氨酸氨酸赖氨酸氨酸天冬氨酸激天冬氨酸激酶-谷氨酸棒状杆菌（高谷氨酸棒状杆菌（高丝氨酸缺陷型）的氨酸缺陷型）的L-L-赖氨酸氨酸发酵代酵代谢控制机制控制机制分支途径分支途径肌苷酸肌苷酸发酵酵（IMPIMP合成途径的代合成途径的代谢调控）控）调控理论的实践应用调控理论的实践应用（二）在次（二）在次级代代谢调节育种中的育种中的应用用（自学）（自学）三、渗漏缺陷型在代三、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的育种中的应用。用。渗漏缺陷型是一种特殊的渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是养缺陷型，是遗传性代性代谢障碍不完全的突障碍不完全的突变型。其特点是型。其特点是酶活力下降而不完全活力下降而不完全丧失，失，并能在基本培养基上少量生并能在基本培养基上少量生长。获得渗漏型的方法是把大得渗漏型的方法是把大量量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生生长特特别慢而菌落小的即可。慢而菌落小的即可。可以利用渗漏缺陷型既能少量地合成代可以利用渗漏缺陷型既能少量地合成代谢终产物，又物，又不造成反不造成反馈抑制的抑制的现象。象。筛选抗反抗反馈调节突突变株，其原理株，其原理类似于似于营养缺陷型，只是不必添加限量的缺陷养缺陷型，只是不必添加限量的缺陷营养屋。养屋。四、抗反四、抗反馈调节突突变株的株的选育育(一一)反反馈调节和抗反和抗反馈调节突突变 1.1.反反馈调节 是指当合成代是指当合成代谢途径的途径的终产物或分支代物或分支代谢途径的途径的终产物物过量量积累累时，抑制合成代，抑制合成代谢途径途径的关的关键酶（往往是代（往往是代谢途径或分支代途径或分支代谢途径第途径第一步的一步的酶）的活力或相关）的活力或相关酶的合成。反的合成。反馈调节分分为反反馈抑制和反抑制和反馈阻遏。阻遏。50 反反馈抑制是指合成代抑制是指合成代谢途径途径终产物物过量量积累累时对该途径前端某些关途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。活性的抑制作用。反反馈阻遏是指微生物合成代阻遏是指微生物合成代谢中高中高浓度度终产物物对该途径上途径上酶合成的抑制作用。合成的抑制作用。反反馈抑制直接以抑制直接以产物物浓度控制关度控制关键酶的活性，从而的活性，从而控制整个代控制整个代谢途径，具有快速、有效、途径，具有快速、有效、经济和直接和直接的特点。的特点。反反馈阻遏作用是胞内阻遏作用是胞内产物物过量后量后终止止酶合成的一种合成的一种机制，与反机制，与反馈抑制相比，反抑制相比，反应较慢，并且往往影响慢，并且往往影响代代谢途径中所有途径中所有酶（整个操（整个操纵子）的合成。子）的合成。51 2.2.抗反抗反馈调节突突变 是指解除了反是指解除了反馈调节的突的突变株，包括抗反株，包括抗反馈抑制突抑制突变和抗反和抗反馈阻遏突阻遏突变。抗反抗反馈抑制突抑制突变是指解除了反是指解除了反馈抑制的突抑制的突变株。株。（调节中心中心发生生结构改构改变，无法与效，无法与效应物物结合合）抗反抗反馈阻遏突阻遏突变是指解除了反是指解除了反馈阻遏的突阻遏的突变株。株。（调节基因突基因突变或操或操纵基因突基因突变）52 3.3.抗反抗反馈调节突突变株的株的筛选 筛选抗抗结构构类似物突似物突变株株 利用回复突利用回复突变筛选 初初级代代谢产物物营养缺陷型回复突养缺陷型回复突变筛选抗反抗反馈调节突突变株（株（野生型营养缺陷型原养型）次次级代代谢产物物营养缺陷型回复突养缺陷型回复突变筛选抗反抗反馈调节突突变株（株（野生型营养缺陷型原养型）次次级代代谢产物零物零产量回复突量回复突变筛选抗反抗反馈调节突突变株（株（高产株零变株高产株）53(二二)抗代抗代谢类似物突似物突变型的型的筛选1.1.代代谢类似物与抗代似物与抗代谢类似物突似物突变 代代谢类似物：似物：结构与（初构与（初级）代）代谢物物类似，因此似，因此可起到代可起到代谢物所具有的物所具有的调节作用而不具作用而不具备其生理其生理功能的一功能的一类化合物。化合物。54 Threonine AHV -Amino-hydroxyvaleric acid -氨基氨基-羟基戊酸羟基戊酸55 Lys AEC S-(2-Aminoethyl)-L-CysteineS-（2氨基乙基）氨基乙基）-L半胱氨酸半胱氨酸56 真正代谢物功能：真正代谢物功能：合成大分子（合成大分子（终产物物一般一般为初初级代代谢产物，物，为生生长必需必需）；）；调节功能（功能（反反馈）代谢类似物：代谢类似物：只有只有调节功能，不能合成功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代有活性的生物大分子。加入代谢类似物，似物，将关将关闭相关代相关代谢物的合成，从而影响微物的合成，从而影响微生物的生生物的生长。57 抗代抗代谢类似物突似物突变株株：在含有代在含有代谢类似物的基本培养基中能似物的基本培养基中能够生生长的菌株的菌株被称作抗代被称作抗代谢类似物突似物突变株。株。通通过基因突基因突变，使，使变构构酶或阻遏蛋白或阻遏蛋白的的结构构发生改生改变，使其不能与代，使其不能与代谢终产物物结合，从而解除了代合，从而解除了代谢终产物的物的反反馈调节作用，作用，所以即使在代所以即使在代谢类似似物存在物存在时，也能合成相关代，也能合成相关代谢物，从物，从而能而能够生生长。58 2.2.抗抗结构构类似物突似物突变株在代株在代谢调控育种中的控育种中的应用用 抗抗结构构类似似物物突突变的的实质是是解解除除了了反反馈抑抑制制或或反反馈阻阻遏遏，因因此此，在在这类突突变株株中中，合合成成代代谢途途径径也也不不再再受受代代谢终产物物的的反反馈调节，能能够在在终产物物过量量积累累的的情情况况下下还不不断断合合成成该产物物，从从而而可可以以大大大大提提高高这些些终产物物的的合合成成量量。抗抗结构构类似似物物突突变在在氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸和和维生生素素等初等初级代代谢产物的高物的高产菌株菌株选育中被广泛育中被广泛应用。用。59 3.3.筛选方法方法 一一次次性性筛选法法：将将经过诱变后后培培养养的的细胞胞直直接接涂涂布布在在含含有有一一定定浓度度结构构类似似物物的的基基本本培培养养基基平平板板上上，长出出的的菌菌落落即即为抗抗结构构类似似物物突突变株株（药物不很物不很贵）；）；梯梯度度平平板板法法：将将经过后后培培养养的的细胞胞涂涂布布在在基基本本培培养养基基平平板板上上，在在平平板板的的中中央央加加少少量量结构构类似似物物，在在抑抑菌菌圈圈内内长出出的的个个别菌菌落落即即为抗抗结构构类似物突似物突变株。株。60 注：注：如果是如果是协同反同反馈抑制，抑制，则要在基本培养基中添要在基本培养基中添加起加起协同反同反馈抑制作用的抑制作用的产物物 抗抗结构构类似物突似物突变是数量性状，可通是数量性状，可通过逐逐渐提提高高结构构类似物的似物的浓度使度使产物的物的积累水平逐累水平逐渐提提高高 抗抗结构构类似物突似物突变和和营养缺陷型突养缺