表达产物的分离纯化.ppt

五、外源基因表达产物的分离纯化五、外源基因表达产物的分离纯化重组蛋白分离纯化方法选择的原则重组蛋白分离纯化方法选择的原则透析和超滤透析和超滤离子交换层析离子交换层析凝胶层析凝胶层析亲和层析亲和层析原核生物表达的重组蛋白质量检测原核生物表达的重组蛋白质量检测（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化1、针对产物的表达形式采取不同的策略、针对产物的表达形式采取不同的策略应先离心回收包涵体。应先离心回收包涵体。样样品品体体积积大大、浓浓度度低低，应应在在纯纯化化前采用沉淀、超滤等方法浓缩处理。前采用沉淀、超滤等方法浓缩处理。一一般般是是胞胞内内可可溶溶性性的的，首首选选亲亲和和层析纯化。层析纯化。包涵体型表达：包涵体型表达：分泌型表达：分泌型表达：融合型表达：融合型表达：2、针对重组蛋白的性质选择不同的层析类型、针对重组蛋白的性质选择不同的层析类型1）离子交换层析：）离子交换层析：是是等等电电点点处处于于极极端端区区域域（pI5或或pI8）重重组蛋白的首选，易除去几乎所有的杂蛋白。组蛋白的首选，易除去几乎所有的杂蛋白。前前提提是是具具备备重重组组蛋蛋白白的的特特异异性性配配体体，如如抗抗体体、受受体体、底底物物等等，且且它它们们与与目目标标蛋蛋白白间间的解离常数的解离常数Kd为为10-8-10-4 mol/L。2）亲和层析：）亲和层析：3）疏水层析）疏水层析：根据蛋白质的疏水性差异分离。根据蛋白质的疏水性差异分离。4）凝胶过滤层析）凝胶过滤层析：根据蛋白的分子量差异分离。根据蛋白的分子量差异分离。3、多种分离纯化技术的联合运用、多种分离纯化技术的联合运用重组蛋白纯化时，通常需综合使用多种技术。重组蛋白纯化时，通常需综合使用多种技术。首先选择能除去含量最多杂质的方法；首先选择能除去含量最多杂质的方法；选择分离纯化方法时，应遵循下列选择分离纯化方法时，应遵循下列原则原则：选择不同分离纯化机理的方法联合使用；选择不同分离纯化机理的方法联合使用；尽量选择高效的分离方法；尽量选择高效的分离方法；将最费时、成本最高的分离纯化方法排在最后。将最费时、成本最高的分离纯化方法排在最后。4、合适分离纯化介质的选择、合适分离纯化介质的选择常用的分离纯化介质：常用的分离纯化介质：葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sepherose）对目标蛋白有较高的分离效率；对目标蛋白有较高的分离效率；理想的分离纯化介质应具有下列理想的分离纯化介质应具有下列性质性质：对目标蛋白不会造成变性；对目标蛋白不会造成变性；化学性能、机械性能稳定，重复性好；化学性能、机械性能稳定，重复性好；价格低廉。价格低廉。5、分离纯化过程的规模化、分离纯化过程的规模化 蛋蛋白白质质分分离离纯纯化化的的实实验验室室方方法法，在在产产业业化化过过程程未必合适，如：未必合适，如：实验室方法在工程上难以实现，如实验室方法在工程上难以实现，如超声超声波破碎胞壁。波破碎胞壁。实验室方法在规模化生产中成本过高，如超速实验室方法在规模化生产中成本过高，如超速离心离心。因此，实验室的技术路线因此，实验室的技术路线=生产工艺。生产工艺。（二）透析和超滤（二）透析和超滤（二）透析和超滤（二）透析和超滤透析：透析：利利用用具具有有一一定定孔孔径径大大小小、高高分分子子溶溶质质不不能能透透过过的的亲亲水水膜膜，将将含含有有高高分分子子溶溶质质和和其其它它小小分分子子溶溶质质的的溶溶液液（左左侧侧）与与纯纯水水或或缓缓冲冲液液（右右侧侧）分分隔隔，由由于于膜膜两两侧侧的的溶溶质质浓浓度度不不同同，在在浓浓度度差差的的作作用用下下，左左侧侧中中的的小小分分子溶质透向右侧，右侧中的水或缓冲液透向左侧。子溶质透向右侧，右侧中的水或缓冲液透向左侧。将将蛋蛋白白质质样样品品装装入入透透析析袋袋，置置于于盛盛有有足足量量透透析析液液的的容容器器中中透透析析，当当袋袋内内、外外小小分分子子趋趋于于平平衡衡时时，更更换换透透析析液液，产产生生新新的的浓浓度度差差，小小分分子子继继续续向向外外扩扩散散，如如此此多多次次重重复复，即即可可将将大大分分子子和和小小分分子子分分离离，分分离离取取决决于透析袋的截留分子量。于透析袋的截留分子量。脱盐；脱盐；去除小分子杂质；去除小分子杂质；置换缓冲液。置换缓冲液。透析的用途：透析的用途：实验室规模的蛋白质分离纯化。实验室规模的蛋白质分离纯化。加压加压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液 超滤：超滤：具具有有一一定定孔孔径径的的半半透透膜膜在在一一定定压压力力下下，膜膜内内小小分分子子能能通通过过膜膜孔孔渗渗透透到到膜膜外外，而而大大分分子子不不能能通通过过，使使大小不同的分子达到分离的目的。大小不同的分子达到分离的目的。实实际际上上是是一一种种高高压压渗渗透透分分离离方方法法，通通过过在在膜膜内内施施加加正正压压、或或在在膜膜外施加负压，使小分子排出膜外。外施加负压，使小分子排出膜外。超滤的用途：超滤的用途：脱盐；脱盐；去除小分子杂质；去除小分子杂质；浓缩；浓缩；除菌。除菌。（三）离子交换层析（三）离子交换层析（三）离子交换层析（三）离子交换层析离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作1、离子交换层析的基本原理、离子交换层析的基本原理 以以离离子子交交换换剂剂为为固固定定相相、以以特特定定含含离离子子溶溶液液为为流流动动相相，利利用用离离子子交交换换剂剂与与待待分分离离的的各各种种离离子子结结合合力力的的差差异异，将将混混合合物物中中不不同同离离子进行分离的层析技术。子进行分离的层析技术。不不结结合合的的先先被被洗洗脱脱下下来来，结结合合力力弱弱的的其其次次，结结合合力力强强的的后后被被洗洗脱脱下下来。来。阳离子交换层析阳离子交换层析2、离子交换剂的基本性质、离子交换剂的基本性质1）亦亦称称离离子子交交换换介介质质，为为不不溶溶性性高高分分子子化化合合物物，如树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。如树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。2）所所含含可可解解离离基基团团在在水水溶溶液液中中能能与与其其它它阴阴、阳阳离离子起交换作用。子起交换作用。3）若若有有两两种种以以上上成成分分吸吸附附在在离离子子交交换换剂剂上上，各各成成分被洗脱的可能性取决于各自反应的解离常数。分被洗脱的可能性取决于各自反应的解离常数。4）通通过过改改变变pH，可可使使吸吸附附在在离离子子交交换换剂剂上上的的蛋蛋白质失去电荷而解离下来。白质失去电荷而解离下来。5）不不同同蛋蛋白白质质与与离离子子交交换换剂剂之之间间形形成成离离子子键键的的数数目目不不同同，即即结结合合力力大大小小不不同同，选选择择适适当当的的洗洗脱脱条条件件（如如改改变变离离子子强强度度），可可将将混混合合物物中中的的成成分分逐个洗脱下来。逐个洗脱下来。离子交换剂的分类离子交换剂的分类带正电荷，结合带带正电荷，结合带负电荷的蛋白质负电荷的蛋白质 强碱型强碱型弱碱型弱碱型阳离子交换剂：阳离子交换剂：阴离子交换剂：阴离子交换剂：选择阴离子还是阳离子交换剂，决定于被分离选择阴离子还是阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。物质所带的电荷性质。带负电荷，结合带带负电荷，结合带正电荷的蛋白质正电荷的蛋白质强酸型强酸型弱酸型弱酸型强离子交换剂：强离子交换剂：弱离子交换剂：弱离子交换剂：电电离离率率受受pH影影响响很很大大，离离子子交交换换作作用用的的pH范围窄。范围窄。电电离离率率基基本本不不受受pH影影响响，离离子子交交换换作作用用的的pH范围宽。范围宽。pH降低时，电离率逐渐降低，离子降低时，电离率逐渐降低，离子交换交换能力逐渐减弱。能力逐渐减弱。弱阴离子交换剂：弱阴离子交换剂：弱阳离子交换剂：弱阳离子交换剂：pH升高时，电离率逐渐降低，离子升高时，电离率逐渐降低，离子交换交换能力逐渐减弱。能力逐渐减弱。常用的离子交换剂常用的离子交换剂1）离子交换树脂）离子交换树脂 常常见见的的是是含含酸酸性性或或碱碱性性基基团团、人人工工合合成成的的聚苯乙烯聚苯乙烯-二乙烯苯不二乙烯苯不溶性高分子化合物。溶性高分子化合物。优优点点：流流速速快快，对对小小分分子子物物质质的的交交换换容容量量大大，适于氨基酸、核苷酸等适于氨基酸、核苷酸等小分子小分子物质的纯化。物质的纯化。2 2）离子交换纤维素）离子交换纤维素）离子交换纤维素）离子交换纤维素 是是是是携携携携带带带带功功功功能能能能基基基基团团团团的的的的纤纤纤纤维维维维素素素素衍衍衍衍生生生生物物物物，有有有有松松松松散散散散的的的的亲亲亲亲水水水水性性性性网网网网状状状状结结结结构构构构和和和和较较较较大大大大表表表表面面面面积积积积，大大大大分分分分子子子子可可可可自自自自由由由由通通通通过过过过，对对对对蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质等等等等生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子的的的的交交交交换换换换容容容容量量量量比比比比离离离离子子子子交交交交换树脂大。换树脂大。换树脂大。换树脂大。阳离子型：阳离子型：羟甲基纤维素羟甲基纤维素(CM纤维素纤维素)；阴离子型：阴离子型：二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素纤维素)。3）离子交换葡聚糖）离子交换葡聚糖 是是葡葡聚聚糖糖经经环环氧氧氯氯丙丙烷烷交交联联后后形形成成的的、具具有有多多孔孔三三维维空空间间网网状状结结构构、离离子子交交换换功功能能基团的多糖衍生物。基团的多糖衍生物。1）亲亲水水性性强强，不不会会引引起起生生物物分分子子的的变变性性、失失活活，母链对蛋白质、核酸等的非特异性吸附小。母链对蛋白质、核酸等的非特异性吸附小。优点：优点：2）电电离离基基团团在在母母体体上上取取代代程程度度高高、交交换换容容量量大大、装柱方便、流速快。装柱方便、流速快。3）既有离子交换作用，又有分子筛效应。）既有离子交换作用，又有分子筛效应。常用的离子交换葡聚糖：常用的离子交换葡聚糖：C后面的数字后面的数字=凝胶吸水量凝胶吸水量 10 C-25：表示：表示1g干燥的凝胶可吸水干燥的凝胶可吸水 DEAE-Sephadex A-25 Q-Sephadex A-25 DEAE-Sephadex A-50 Q-Sephadex A-50 CM-Sephadex C-25 SP Sephadex C-25 CM-Sephadex C-50 SP Sephadex C-50 阳离子型：阳离子型：阴离子型：阴离子型：4）离子交换琼脂糖）离子交换琼脂糖CM-Sepharose 是是携携带带DEAE或或CM基基团团的的Sepharose CL-6B，具具有有硬硬度度大大、性性质质稳稳定定、流流速速好好、分分离离能能力力强强等等优优点点，受受pH和和离离子子强强度度影影响响引引起起的的膨膨胀胀和和收收缩缩效效应应小，外形和体积稳定。小，外形和体积稳定。DEAE-Sepharose阴离子型阴离子型：阳离子型阳离子型：3、离子交换介质的选择原则、离子交换介质的选择原则碱性物质碱性物质：用阳离子交换剂分离。：用阳离子交换剂分离。酸性物质酸性物质：用阴离子交换剂分离。：用阴离子交换剂分离。两性电解质两性电解质（如（如氨基酸、核苷酸、蛋白质）：氨基酸、核苷酸、蛋白质）：根据其根据其pI值及离子化曲线来选择。值及离子化曲线来选择。12346789105pH+-蛋蛋白白质质净净电电荷荷等电点等电点吸附阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附阳离子交换剂pHpI（-）对对pI=5的某蛋白质：的某蛋白质：在在pH5.5-9.0范围内，范围内，蛋白质为阴离子，蛋白质为阴离子，首选首选DEAE纤维素。纤维素。在在pH3.5-4.5范围内，范围内，蛋白质为阳离子，蛋白质为阳离子，首选首选CM纤维素。纤维素。层析柱平衡层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍；倍；平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速；平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速；平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值值与缓冲液一致为准，其中与缓冲液一致为准，其中pH值最重要。值最重要。4、离子交换层析的基本操作、离子交换层析的基本操作样品进柱样品进柱交换容量：交换容量：离子交换剂中可交换的离子或功能基团的总数。离子交换剂中可交换的离子或功能基团的总数。为为达达满满意意的的分分离离效效果果，进进样样量量一一般般为为介介质质交交换换容量的容量的10-20%。为为避避免免进进样样溶溶液液中中的的离离子子强强度度过过高高，样样品品浓浓度度不宜太高不宜太高。样品洗脱样品洗脱恒定洗脱恒定洗脱梯度洗脱梯度洗脱线性洗脱线性洗脱101020203030404050506060707080809090分子浓度分子浓度离子强度离子强度pH值值（四）凝胶层析（四）凝胶层析（四）凝胶层析（四）凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作1、凝胶层析的基本原理、凝胶层析的基本原理 凝胶层析是以有一定孔径范围的多孔凝凝胶层析是以有一定孔径范围的多孔凝胶为固定相，对混合物中各组份按分子大小胶为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称进行分离的层析技术，又称分子筛分子筛。2、小小分分子子物物质质要要通通过过凝凝胶胶网网孔孔进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，迁迁移移速速度慢度慢。1、大大分分子子物物质质不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，随随洗洗脱脱液液从从凝凝胶胶颗颗粒粒之之间间的的空空隙隙挤挤落落下下来来，迁迁移移速度快速度快；原理：原理：分分子子直直径径比比凝凝胶胶最最大大孔孔隙隙直直径径大大的的，会会被被全全部部排排阻阻在在凝凝胶胶颗颗粒粒之之外外，即即使使大大小小不不同同，也也不不能能分开，它们的下行速度快。分开，它们的下行速度快。分分子子直直径径比比凝凝胶胶最最小小孔孔隙隙直直径径小小的的，能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒的的全全部部孔孔隙隙，即即使使大大小小不不同同，也也不不能能分分开，它们的下行速度慢。开，它们的下行速度慢。注意：注意：2 2、凝胶介质的基本性质、凝胶介质的基本性质、凝胶介质的基本性质、凝胶介质的基本性质 葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶对对碱碱稳稳定定，在在酸酸性性环环境境中中糖糖苷苷键键易易水水解解；湿湿态态的的葡葡聚聚糖糖可可加加热热到到110，干干的的能能耐受耐受120高温。高温。1）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶 种种类类有有Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50表表示示1g干干凝凝胶胶吸水量为吸水量为5ml。Sephadex LH是是羟羟丙丙基基化化的的Sephadex，流流动动相相既既可可使使用用缓缓冲冲水水溶溶液液，也也可可使使用用极极性性有有机机溶溶剂剂，因因此此适适用用于于非非水水溶溶性性溶溶质质的的凝凝胶胶过滤。过滤。Sepharose：Sepharose 2B、4B、6B （数字代表干胶的百分比）数字代表干胶的百分比）Bio-Gel-A：Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M （数字（数字106代表排阻限度）代表排阻限度）2）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶是是从从琼琼脂脂中中分分离离出出的的天天然然凝凝胶胶，常见的有：常见的有：温温度度高高于于50时时，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶融融化化，只只能能在在较低温度下使用。较低温度下使用。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶是是一一种种大大孔孔凝凝胶胶，适适于于分分离离分分子子量较大的生物大分子（如蛋白质、量较大的生物大分子（如蛋白质、DNA）。Sepharose CL是是二二溴溴丙丙醇醇交交联联琼琼脂脂糖糖，孔孔径径大大小小和和分分离离范范围围同同普普通通琼琼脂脂糖糖，但但热热和和化化学学稳稳定定性增加，能性增加，能高温高温消毒。消毒。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶商商品品名名为为Bio-Gel，型型号号从从P-2至至P-300共共10种（数字种（数字1000为排阻限度）。为排阻限度）。3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是一一种种以以丙丙烯烯酰酰胺胺为为单单位位、由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶。由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶。控控制制交交联联剂剂的的用用量量可可制制成成各各种种型型号号的的凝凝胶胶，交联剂越多、孔隙越小。交联剂越多、孔隙越小。3、凝胶介质的选用原则、凝胶介质的选用原则 将将样样品品中中的的大大分分子子和和小小分分子子物物质质分分开开，称称为为组组别别分分离离，分分离离策策略略是是使使高高分分子子物物质质完完全全被被排排阻阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝胶内。1）组别分离）组别分离 一一般般选选Sephadex G-25或或G-50，对对于于小小肽肽和和小小分分子子物物质质的的脱脱盐盐，可可选选Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或或P-4。将将样样品品中中一一些些分分子子量量较较接接近近的的物物质质分分开开，称为称为分级分离分级分离。2）分级分离）分级分离 一一般般选选排排阻阻限限度度略略大大于于样样品品中中最最高高分分子子量量物物质质的的凝凝胶胶。样样品品中中各各组组份份均均能能不不同同程程度度地地深深入入凝凝胶胶内内部部，由由于于深深入入凝凝胶胶空空隙隙程程度度的的差差异异，得以分离。得以分离。4、凝胶层析的基本操作、凝胶层析的基本操作注意凝胶的断层和气泡。注意凝胶的断层和气泡。层析柱平衡：层析柱平衡：操作压控制：操作压控制：恒定的操作压是恒流的先决条件。恒定的操作压是恒流的先决条件。平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速；平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速；平衡和洗脱时应维持流速恒定；平衡和洗脱时应维持流速恒定；上柱样品溶液的体积根据分离要求确定：上柱样品溶液的体积根据分离要求确定：进样体积进样体积分分级级分分离离：样样品品溶溶液液的的体体积积要要小小(1-2%)，使使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好。样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好。组别分离组别分离：样品溶液最大可为柱体积的：样品溶液最大可为柱体积的10%；（五）亲和层析（五）亲和层析（五）亲和层析（五）亲和层析亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作1、亲和层析的基本概念、亲和层析的基本概念 亲亲和和层层析析是是利利用用待待分分离离物物质质与与其其特特异异性性配配体体之之间间的的特特异异性性亲亲和和力力，进进行行分分离离的的一类一类特殊的层析技术。特殊的层析技术。亲和层析的基本特点亲和层析的基本特点1）纯化过程简单、迅速，分离效率高。）纯化过程简单、迅速，分离效率高。特点：特点：2）特特别别适适于于分分离离纯纯化化含含量量低低、稳稳定定性性差差的的生生物物大分子。大分子。4）必必须须针针对对某某一一分分离离对对象象，制制备备专专一一配配基基，应应用范围受一定限制。用范围受一定限制。3）产物纯度高。）产物纯度高。抗原与抗体；抗原与抗体；DNA与互补与互补DNA或或RNA；酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子；酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子；激素或药物与其受体；激素或药物与其受体；维生素与其特异性结合蛋白；维生素与其特异性结合蛋白；糖蛋白与其相应的植物凝集素。糖蛋白与其相应的植物凝集素。具有特异性亲和作用的生物分子具有特异性亲和作用的生物分子1）亲亲和和的的一一对对分分子子中中，一一方方以以共共价价键键与与不不溶溶性性载体相连作为固定相吸附剂；载体相连作为固定相吸附剂；亲和层析的基本原理亲和层析的基本原理2）当当样样品品(流流动动相相)通通过过固固定定相相时时，只只有有与与其其有有特特异异亲亲和和力力的的物物质质，才才能能被被吸吸附附，无无关关组组份份随随流流动相流出；动相流出；3）改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。）改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。2、亲和层析载体的性质与选择、亲和层析载体的性质与选择有多孔立体网状结构，能使吸附的大分子自由通过；有多孔立体网状结构，能使吸附的大分子自由通过；亲和层析载体的选择亲和层析载体的选择均匀珠状颗粒具有良好的机械性能、良好的流速；均匀珠状颗粒具有良好的机械性能、良好的流速；有相当量的易活化基团，温和条件下能与配基共价偶联；有相当量的易活化基团，温和条件下能与配基共价偶联；具有惰性，尽量减少非专一性吸附；具有惰性，尽量减少非专一性吸附；在偶联、吸附和洗脱时，有较好的理化稳定性。在偶联、吸附和洗脱时，有较好的理化稳定性。纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体3 3、亲和层析配基的性质与选择、亲和层析配基的性质与选择、亲和层析配基的性质与选择、亲和层析配基的性质与选择纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力；纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力；亲和层析配基的选择亲和层析配基的选择亲亲和和力力太太高高也也有有害害，在在解解离离配配基基复复合合物物时时所所需需的条件就强烈，可能使生物分子变性；的条件就强烈，可能使生物分子变性；配配基基必必须须有有适适当当的的化化学学基基团团，用用于于连连接接载载体体，基基团团不不参参与与配配基基和和生生物物分分子子之之间间特特异异结结合合，也也不影响二者的亲和力。不影响二者的亲和力。酸酐法酸酐法N-取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法叠氮化作用叠氮化作用还原性烷基化合物还原性烷基化合物(西夫碱西夫碱)的形成的形成配基的偶联配基的偶联4、亲和层析的基本操作、亲和层析的基本操作 采采用用改改变变pH、离离子子强强度度、离离子子种种类类、温温度度，使使与与固固定定配配基基结结合合的的生生物物大大分分子子构构象发生变化，降低其亲和力。象发生变化，降低其亲和力。1）非专一性洗脱）非专一性洗脱 使用广泛的是改变溶液的使用广泛的是改变溶液的离子强度离子强度。使用使用特异的配基特异的配基作为洗脱剂。作为洗脱剂。2）专一性洗脱）专一性洗脱 使使用用含含有有与与亲亲和和配配基基或或目目标标产产物物有有亲亲和和作作用用的的小小分分子子化化合合物物溶溶液液为为洗洗脱脱剂剂，通通过过竞竞争性结合，来洗脱目标产物。争性结合，来洗脱目标产物。含配体溶液含配体溶液混合蛋混合蛋白样品白样品平衡液平衡液带带有有配配体体的的树树脂脂珠珠收集目收集目的蛋白的蛋白洗下未结洗下未结合的蛋白合的蛋白目的蛋白目的蛋白配体配体配体与配体与树脂珠结合树脂珠结合 实实际际上上，特特殊殊性性洗洗脱脱法法是是一一种种非非特特异异性性洗脱方法。洗脱方法。3）特殊性洗脱）特殊性洗脱 若若亲亲和和双双方方吸吸附附能能力力很很强强，可可用用专专一一的的化化学学方方法法，裂裂解解配配基基与与载载体体的的连连接接键键，获获得得配基配基-蛋白络合物后，再除去配基。蛋白络合物后，再除去配基。（六）重组蛋白的质量检测（六）重组蛋白的质量检测（六）重组蛋白的质量检测（六）重组蛋白的质量检测 工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标：重组蛋白的质量控制指标：鉴别（序列）鉴别（序列）纯度（杂质的类型）纯度（杂质的类型）活性（检测方法）活性（检测方法）安全性安全性稳定性稳定性一致性（构象与构型）一致性（构象与构型）原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法检测项目检测项目 检测方法检测方法是否含内毒素是否含内毒素是否变异是否变异甲硫氨酸是否被甲酰化甲硫氨酸是否被甲酰化 是否变性、聚合、脱氨基是否变性、聚合、脱氨基配体是否脱落配体是否脱落 氨基酸是否发生取代氨基酸是否发生取代 是否被细菌、病毒、支原体污染是否被细菌、病毒、支原体污染家兔热原法家兔热原法肽谱、肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳等电聚焦、毛细管电泳肽谱、质谱、肽谱、质谱、HPLC、Edman分析分析SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质凝胶层析、等电聚焦、质谱、谱、HPLC、毛细管电泳、毛细管电泳、Edman分析分析SDS-PAGE、免疫分析免疫分析氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳微生物学检测微生物学检测