《HPLC方法学》PPT课件.ppt

1总论 2卓有成效的工作方法3样品的性质和预处理4分离的基础5系统方法的建立6保证柱寿命和性能的步骤绝大多数实验室中，HPLC方法的建立仍在靠经验进行首先进行反相色谱实验，调整流动相中有机相的比例，以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。改用不同的色谱柱，改变温度和流动相pH值，优化筛选溶剂的配比组成，以其它溶剂代替原来有机溶剂。或者试用别的HPLC方法1 首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性）2设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。3 预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。4 有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。5 应对每次实验进行设计，能提供有用信息。6 HPLC的目的是分离，而不必使所需谱峰“过渡分离”。可直接进样的样品溶液需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液能在流动相中溶解的固体含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前 将其去除的溶液含有不容性赋性剂的混合物（动植物组织，高交联度聚合物、干性黏合剂）绝大多数样品需经称重或稀释后进样，一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。Rs=(t2-t1)/(1/2(w1+w2)t1，t2 为二相邻谱带间的保留时间，w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs时 为完全分离。当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽，更的办法好是用半高处的相应峰宽1和2：Rs=1.18(t2-t1)/(1+2)Rs在一般情况下，能达到99的分离度。新柱的起始色谱图的Rs值越大，意味着该柱用此法时间越长。Rs时 定量分析一般精密度较差。Rs=(1/4)(-1)Nk/(1+k)k代表了溶剂强度；为分离因子；N为理论塔板数。溶剂强度的增大，Rs增大，满意的范围1 k20在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。温度的选择性，温度的变化会影响分离度，因为理解的程度与温度有关。一般塔板数越大，分离度越好合格的HPLC的塔板数，一般不应低于标准值的80，否则为不合格。流速适中，过高会降低塔板数。当流动相粘度增加时，塔板数会降低，对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。工作压力：低于150bar操作时间：应尽可能短峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好保留值与分离度的重现性1选柱时，应考虑其化学性质2在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，尽量减少谱峰拖尾。3保证温度、流速、和压力、溶剂成分恒定4脱气5保证上样不超载 110ug/mg填料。6使用同一批生产批号的材料柱坏污物在柱进口处堆积样品超载样品溶剂不合适化学或次级保留效应缓冲不足重金属污染进样阀体积过大进样阀、色谱柱及检测器之间的管线过长或直径过粗检测器流动池体积过大1检测条件的选择2梯度洗脱进行首次实验3优化流动相的选择性提高分离度有三种方法：1 提高塔板数2 改变有机相比例，以改变谱峰间距3 更换流动相溶剂，以改变谱峰间距一次初始的梯度操作通常足以判断出大约正确的溶剂强度的流动相，使样品充分分离，通过分析谱峰，简化分确定离条件的步骤建议用乙腈/水作流动相进行首次分离乙腈操作压力低，溶剂强度高，检测波长宽：可在185205nm检测其他有机溶剂：甲醇，丙醇，异丙醇，四氢呋喃MeOH,ACN,THF似乎可以满足反相HPLC要求：容易样品：ACN/水一般样品：MeOH/水 THF/水1选择标准梯度条件进行首次实验乙腈/水510025min,2ml/min或乙腈/水510050min,1ml/min2 调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费3 如果色谱峰复杂，分离较差：延长梯度时间加长柱长使用细粒度的柱降低流速以提高塔板数4 一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距5 需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂色谱平衡通常情况下，柱子用1520柱体积的起始流动相充分冲洗后方可达到柱平衡。柱再生所需时间通常约等于梯度时间。基线问题等梯度HPLC1 选择好填充柱2 减小压力波动，避免冲撞击3 用保护柱和在线过滤片4 经常用强溶剂冲洗柱子：反相用1:1的异丙醇/氯仿，正相用甲醇5 样品预处理，尽量减少无谓的强滞留成分和微粒6 用较柔和的pH值37；防止键和相的流失7 储存时冲洗掉盐缓冲液，以纯乙腈保存柱，避免高浓度的水和醇类