《基因表达载体构建》PPT课件.ppt

二二 基因表达载体的构建基因表达载体的构建思考与讨论：思考与讨论：1 基因载体必须具备的基本条件是什么？基因载体必须具备的基本条件是什么？2 基因工程可做载体的结构有那些？最基因工程可做载体的结构有那些？最常常 使使 用用 的载体是什么？的载体是什么？3 请图示大肠杆菌质粒结构。请图示大肠杆菌质粒结构。4 从苏云金芽孢杆菌细胞从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中，如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中，那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？达吗？5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因 进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你 应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗？（一（一）基因表达载体的构建）基因表达载体的构建2 请你定义：基因表达载体构建之含义？请你定义：基因表达载体构建之含义？1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的基因工程操作中，构建基因表达载体之目的 是什么？是什么？将目的基因、启动子和终止子科学按装将目的基因、启动子和终止子科学按装在经修饰和改造完备的载体之上。在经修饰和改造完备的载体之上。确保目的基因在受体细胞中稳定存在、确保目的基因在受体细胞中稳定存在、复制、遗传和表达，使其发挥作用。复制、遗传和表达，使其发挥作用。3 基因表达载体之基本组成是什么？基因表达载体之基本组成是什么？（1）结构基因）结构基因即提取的目的基因核苷酸序列，负责即提取的目的基因核苷酸序列，负责 编码目标蛋白质。编码目标蛋白质。（2）启动子）启动子位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结 构的构的DNA片段，片段，RNA聚合酶的识别部位和结合部位。聚合酶的识别部位和结合部位。（3）终止子）终止子位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊 结构的结构的DNA片段，具有终止基因转录过程的作用。片段，具有终止基因转录过程的作用。（4）复制原点）复制原点能够自我复制保证目的基因在受体细能够自我复制保证目的基因在受体细 胞中复制遗传和表达。胞中复制遗传和表达。（5）遗传标记基因）遗传标记基因检测受体细胞中是否含有目的基检测受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。请你以质粒作载体构建基因表达载体之模式图请你以质粒作载体构建基因表达载体之模式图基因表达载体基因表达载体基因表达载体启动子启动子复制原点复制原点终止子终止子插入目的基因插入目的基因遗传标记基因遗传标记基因4 建构基因表达载体方法建构基因表达载体方法（2）用同种限制酶切割目标）用同种限制酶切割目标DNA分子，截取目分子，截取目 的基因，使其产生与质粒相同的末端。的基因，使其产生与质粒相同的末端。（1）用某种限制酶如）用某种限制酶如EcoRI限制酶，在基因插限制酶，在基因插 入位点切割质粒，使质粒出现一个切口，入位点切割质粒，使质粒出现一个切口，露出两个黏性末端。露出两个黏性末端。（3）依据目的基因表达的特点和位置，用限制）依据目的基因表达的特点和位置，用限制 酶切割受体细胞相应的控制元件酶切割受体细胞相应的控制元件 启动启动 子和终止子。子和终止子。（4）用限制酶将启动子和终止子与目的基因连）用限制酶将启动子和终止子与目的基因连 接起来，成为一个整体。接起来，成为一个整体。（5）将目的）将目的 基因基因 插入质插入质 粒切口处，用粒切口处，用 Ecoli DNA连接酶把基因与质粒缝合起来，成功连接酶把基因与质粒缝合起来，成功 创建一个重组创建一个重组DNA分子。分子。建议模拟完成建构大肠杆菌基因表达载体建议模拟完成建构大肠杆菌基因表达载体，并写出具体步骤。，并写出具体步骤。三三 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 基因导入受体细胞的标志是什么？基因导入受体细胞的标志是什么？1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗传和表达。或目的基因插入细胞染色体上传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分分子之中，随同受体细胞子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表分子复制、遗传和表达。达。2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部分，这种现象叫做转化。分，这种现象叫做转化。2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。（一）将目的基因导入植物细胞（一）将目的基因导入植物细胞 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，在农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，而自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染力对大多数单子叶植物没有感染力。2 感染原理：感染原理：当植物体受到损伤时，伤口处细胞分泌大当植物体受到损伤时，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的这时农杆菌中的Ti质粒上的质粒上的TDNA分子可转分子可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色DNA分子之上。分子之上。1 农杆菌转化法农杆菌转化法目标农杆菌转化法示意图农杆菌转化法示意图农杆菌农杆菌目标细胞目标细胞Ti质粒质粒TDNA核核DNAEcoRI酶酶DNA重组重组农杆菌农杆菌转基因植物转基因植物侵染侵染转化转化（二）（二）将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞2 实例实例1基因工程培育转基因动物最常用、最有效的基因工程培育转基因动物最常用、最有效的2 方法方法显微注射技术显微注射技术（1）将含有目的基因的表达载体提纯；）将含有目的基因的表达载体提纯；（2）从雌性动物体内取出受精卵细胞。）从雌性动物体内取出受精卵细胞。（3）用显微注射仪把目的基因注射到受精卵细胞；）用显微注射仪把目的基因注射到受精卵细胞；（4）把含有目的基因的受精卵移植到雌性动物子）把含有目的基因的受精卵移植到雌性动物子 宫或输卵管发育成具备新性状的动物。宫或输卵管发育成具备新性状的动物。世界上第一例体型比普通小鼠大世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转倍的转基因基因“超级小鼠超级小鼠”就是用显微注射技术获得成就是用显微注射技术获得成功。功。（三）（三）将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是：目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是：1 用用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够够吸收环境中吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。为感受态细胞。2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基因因质粒重组质粒重组DNA分子。分子。3 将基因将基因质粒重组质粒重组DNA分子与感受态细胞分子与感受态细胞混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重组组DNA分子，完成转化过程。分子，完成转化过程。