生物化学教程蛋白质的性质.ppt

第五节第五节 蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质（一）蛋白质的两性解离和等电点（一）蛋白质的两性解离和等电点（pIpI）（二）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（二）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（三）蛋白质的变性（三）蛋白质的变性（四）蛋白质的水解（四）蛋白质的水解（五）蛋白质的颜色反应（五）蛋白质的颜色反应（一）蛋白质的两性解离和等电点（一）蛋白质的两性解离和等电点（pIpI）、两性解离、两性解离、蛋白质的等电点（、蛋白质的等电点（pI）、电泳、电泳、两性游离、两性游离 NH3+Pr COOH NH3+Pr COO-NH3 Pr COO-OH-OH-H+H+阳离子阳离子阴离子阴离子兼性离子兼性离子（pHPI）（pH=PI）（pHPI）、蛋白质的等电点（、蛋白质的等电点（pI）当溶液处于某一当溶液处于某一pH值，蛋白质分子所带正、值，蛋白质分子所带正、负电荷相等，净电荷为零，呈兼性离子状态，负电荷相等，净电荷为零，呈兼性离子状态，此时溶液的此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点值称为该蛋白质的等电点（pI）。）。不同的蛋白质，其等电点（不同的蛋白质，其等电点（pI）不同。）不同。npI是蛋白质的特征性常数。是蛋白质的特征性常数。n利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。几种蛋白质的等电点（几种蛋白质的等电点（pI）蛋白质名称蛋白质名称 来源来源 pI 血清蛋白血清蛋白 人血人血 肌球蛋白肌球蛋白 肌肉肌肉 7.0 胃蛋白酶胃蛋白酶 猪胃猪胃 胰蛋白酶胰蛋白酶 胰液胰液 卵清蛋白卵清蛋白 鸡蛋鸡蛋 白明胶白明胶 动物皮动物皮 、电泳、电泳 带电颗粒向与其电荷相反的电极方带电颗粒向与其电荷相反的电极方向移动。向移动。意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和分子量的测定。分子量的测定。血清蛋白电泳图谱：血清蛋白电泳图谱：+-清蛋白清蛋白12球球蛋白蛋白电泳电泳 蛋白质在等电点蛋白质在等电点pHpH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。电泳方法：电泳方法：v自由界面电泳自由界面电泳v区带电泳区带电泳纸电泳纸电泳凝胶电泳凝胶电泳圆盘电泳圆盘电泳平板电泳平板电泳（二）（二）蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀1、蛋白质是、蛋白质是高分子化合物高分子化合物，分子量多在，分子量多在1万万100万之间。万之间。2、球状蛋白质的颗粒大小达、球状蛋白质的颗粒大小达1100 nm范围，范围，故蛋白质有胶体性质。蛋白质水溶液是一种比故蛋白质有胶体性质。蛋白质水溶液是一种比较稳定的较稳定的亲水胶体亲水胶体。3、蛋白质分子大，、蛋白质分子大，不能透过半透膜不能透过半透膜。4、蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心，可发、蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心，可发生生沉降沉降。蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n颗粒大小：在颗粒大小：在1 1100nm100nm之间。属胶体。因此溶于之间。属胶体。因此溶于水，成为亲水胶体。水，成为亲水胶体。n稳定亲水胶体的因素：稳定亲水胶体的因素：水化膜水化膜 表面电荷表面电荷 不通透性：半透膜不通透性：半透膜 透析的原理：透析的原理：透析透析n 将蛋白质溶液将蛋白质溶液(不纯不纯)放入透析袋中，放入透析袋中，放在流水中（纯水），让低分子杂质放在流水中（纯水），让低分子杂质（如盐类）透过半透膜扩散入水内，蛋（如盐类）透过半透膜扩散入水内，蛋白质则留在袋中，分离纯化蛋白质。白质则留在袋中，分离纯化蛋白质。半透膜阻留半透膜阻留pr分子，分子，而让小的溶质分子而让小的溶质分子和水通过，以达到和水通过，以达到除去蛋白质溶液中除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分小分子（盐、低分子酸等）。子酸等）。沉降作用沉降作用n1 1、沉降概念：、沉降概念：蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋白质浓度增高。白质浓度增高。n2 2、沉降速率：、沉降速率：在离心时，蛋白质分子在单位时间在离心时，蛋白质分子在单位时间t t（以（以秒计）内下沉的距离秒计）内下沉的距离x x（以（以cmcm计）。以计）。以v v表示。表示。v=dx/dtv=dx/dt沉降作用沉降作用n1、沉降概念：、沉降概念：n2、沉降速率：、沉降速率：v=dx/dtn3、沉降常数（沉降系数，、沉降常数（沉降系数，S）单位引力场沉降分子下沉的速率。单位引力场沉降分子下沉的速率。S=v/S=v/2 2x x v v：沉降速率（：沉降速率（dx/dtdx/dt）可以从实验测得。）可以从实验测得。：离心机转子每秒钟的角速度，以弧度：离心机转子每秒钟的角速度，以弧度/秒计。（即秒计。（即2 2 转子每秒钟的转速）转子每秒钟的转速）x x：蛋白质界面中点与转子中心之间的距离（以：蛋白质界面中点与转子中心之间的距离（以cmcm计）。计）。Svedberg单位的定义：单位的定义：n单位引力场沉降分子下沉的速率。单位引力场沉降分子下沉的速率。n取取 1 1010-13-13秒为一个秒为一个Svedberg单位。单位。n例：例：牛血清清蛋白牛血清清蛋白的沉降常数为的沉降常数为:1010-13-13用用Svedberg单位则为单位则为:4.4 S4.4 S原核细胞核糖体原核细胞核糖体的沉降常数为的沉降常数为:70107010-13-13用用Svedberg单位则为单位则为:70 S70 S蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀1、概念：、概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中蛋白质分子发生凝聚，从溶液中析出的现象。析出的现象。2、蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶、蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。体。稳定因素：水化膜稳定因素：水化膜 电荷电荷 破坏稳定因素，就可使蛋白质颗粒破坏稳定因素，就可使蛋白质颗粒凝聚而沉淀。凝聚而沉淀。3、沉淀方法：、沉淀方法：盐析法盐析法有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀重金属盐沉淀条件重金属盐沉淀条件:pHpI (Pr-M+)某些酸类沉淀条件：某些酸类沉淀条件：pHpI (Pr+X-)加热变性沉淀加热变性沉淀盐析法盐析法n加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出。加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出。nNaClNaCl、（NHNH4 4）2 2SOSO4 4、NaSONaSO4 4等。等。n破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。n分段盐析：调节盐浓度，可使混合分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液蛋白质溶液中的几种蛋白质中的几种蛋白质分段析出。分段析出。n分离制备分离制备蛋白质的常用方法。蛋白质的常用方法。有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n有机溶剂：乙醇、丙酮等。有机溶剂：乙醇、丙酮等。n破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。npH=pIpH=pI时，可加速蛋白质沉淀。时，可加速蛋白质沉淀。n低温（低温（04 04）。）。重金属盐沉淀重金属盐沉淀反应条件反应条件:pHpI NH3+Pr COO-NH2Pr COO-OH-M+NH2Pr COO-M+不溶性蛋白盐不溶性蛋白盐氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。M+：重金属离子重金属离子某些酸类沉淀某些酸类沉淀反应条件反应条件:pHpI NH3+Pr COO-NH3+Pr COOHH+X-NH3+X-Pr COOH不溶性蛋白盐不溶性蛋白盐苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。X-：酸根：酸根一些常见的蛋白质沉淀剂n、盐：盐：破坏水膜，中和电荷破坏水膜，中和电荷盐溶、盐析的概念盐溶、盐析的概念n、有机溶剂有机溶剂：破坏水膜：破坏水膜n、重金属盐重金属盐：n、一些酸类物质一些酸类物质：与蛋白质生成不：与蛋白质生成不溶性盐。如：苦味酸、单宁酸、溶性盐。如：苦味酸、单宁酸、4、应用：、应用：n蛋白质的分离制备蛋白质的分离制备n灭菌技术灭菌技术n生物样品的分析、杂质除去等都要涉及生物样品的分析、杂质除去等都要涉及此反应。此反应。（三）蛋白质的变性（三）蛋白质的变性1、概念：概念：蛋白质在某些理化因素的作用下，蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构（次级键，特别是氢键）被其空间结构（次级键，特别是氢键）被破坏，从而改变其理化性质，并失去生破坏，从而改变其理化性质，并失去生物活性，这称为蛋白质的变性。物活性，这称为蛋白质的变性。蛋白质的变性蛋白质的变性（三）蛋白质的变性（三）蛋白质的变性2、变性因素：、变性因素：物理因素：物理因素：加热、高压、振荡或搅拌、紫外线照射、加热、高压、振荡或搅拌、紫外线照射、超声波及射线等。超声波及射线等。化学因素：化学因素：强酸、强碱、重金属离子和尿素、乙醇、强酸、强碱、重金属离子和尿素、乙醇、丙醇等有机溶剂。丙醇等有机溶剂。3、变性实质：、变性实质：维系蛋白质空间结构的次级键断裂，维系蛋白质空间结构的次级键断裂，其特定的空间结构被改变或破坏。其特定的空间结构被改变或破坏。n二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。及一级结构的改变。n蛋白质变性的主要标志是生物功能的丧失。蛋白质变性的主要标志是生物功能的丧失。介电常数介电常数n介电常数是两种电荷被真空隔绝时的电介电常数是两种电荷被真空隔绝时的电势与被介质隔绝时的电势的比值。势与被介质隔绝时的电势的比值。n表示介质影响相反电荷间吸力的数值。表示介质影响相反电荷间吸力的数值。4、变性蛋白质的特征：、变性蛋白质的特征：理化性质的改变：理化性质的改变：溶解度降低；溶解度降低；粘度上升；粘度上升；易被蛋白酶水解；易被蛋白酶水解；不能结晶。不能结晶。生物学性质的改变生物学性质的改变 生物活性表失生物活性表失（酶失去其催化活性、（酶失去其催化活性、激素失去其调节性、抗体失去其生物活激素失去其调节性、抗体失去其生物活性、细菌蛋白失去其致病性。）性、细菌蛋白失去其致病性。）一些与食品相关的蛋白质的热变性温度一些与食品相关的蛋白质的热变性温度/蛋白质蛋白质热变性温度热变性温度 蛋白质蛋白质热变性温度热变性温度牛血清白蛋白牛血清白蛋白血红蛋白血红蛋白鸡蛋白蛋白鸡蛋白蛋白肌红蛋白肌红蛋白 65 67 76 79-乳清蛋白乳清蛋白-乳球蛋白乳球蛋白 大豆球蛋白大豆球蛋白 燕麦球蛋白燕麦球蛋白 83 83 92 108n蛋白质的变性程度较轻时，去除变蛋白质的变性程度较轻时，去除变性因素后，蛋白质恢复原有空间构性因素后，蛋白质恢复原有空间构象和生物活性的现象称为复性。象和生物活性的现象称为复性。复性复性(renaturation)renaturation)去除尿素，去除尿素，-巯基乙醇巯基乙醇天然状态，天然状态，-SH 氧化形成氧化形成-S-S-，有催化活性有催化活性非折叠状态，无活性，非折叠状态，无活性，-S-S-被还原成被还原成-SHSHSHSHSHSHSHSHSH尿素，尿素，-巯基乙醇巯基乙醇天然状态，有催化活性天然状态，有催化活性牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶、实际应用、实际应用 消毒灭菌消毒灭菌中毒的急救中毒的急救临床检验临床检验保存和制备生物制剂保存和制备生物制剂有利于蛋白食物的消化吸收有利于蛋白食物的消化吸收蛋白质的凝固蛋白质的凝固n变性蛋白质分子变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠互相凝聚或互相穿插缠绕（结）在一起的现象。绕（结）在一起的现象。n蒸蛋蒸蛋（四）蛋白质的水解（四）蛋白质的水解蛋白质蛋白质蛋白胨蛋白胨 小肽小肽二肽二肽氨基酸氨基酸 检查蛋白质水解程度的方法：检查蛋白质水解程度的方法：n用用Van Slyke Van Slyke 测自由氨基的方法，当水解完测自由氨基的方法，当水解完全时，自由氨基全时，自由氨基N N趋于恒定。趋于恒定。n用检查双缩脲反应的消失（水解完全后就不用检查双缩脲反应的消失（水解完全后就不再呈阳性反应）。再呈阳性反应）。与亚硝酸的反应与亚硝酸的反应 HNO2 亚硝酸亚硝酸RCHCOOHNH2 氨基酸氨基酸RCHCOOH+N2 +H2O OH 羟基酸羟基酸（五）蛋白质的颜色反应（五）蛋白质的颜色反应n作为蛋白质的定性和定量试验。作为蛋白质的定性和定量试验。n作为分析氨基酸的显色反应。作为分析氨基酸的显色反应。n作为检验蛋白质水解是否完全。作为检验蛋白质水解是否完全。1 1、双缩脲反应、双缩脲反应C=ONH2NH2C=ONH2NH2加热加热180 C=ONH2NHC=ONH2+NH3双缩脲双缩脲尿素尿素1 1、双缩脲反应、双缩脲反应C=ONH2NHC=ONH2+CuSO4双缩脲双缩脲紫红色化合物紫红色化合物1 1、双缩脲反应、双缩脲反应加热加热稀碱溶液稀碱溶液 CuSO4 蛋白质或多肽蛋白质或多肽紫红色紫红色 氨基酸不出现此反应。当蛋白质溶液中蛋白氨基酸不出现此反应。当蛋白质溶液中蛋白质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双缩质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双缩脲呈色的深度就逐渐下降，因此双缩脲反应可检脲呈色的深度就逐渐下降，因此双缩脲反应可检测蛋白质水解程度。测蛋白质水解程度。2 2、与水合茚三酮的反应、与水合茚三酮的反应OO OHOH2+沸腾沸腾蓝紫色化合物蓝紫色化合物蛋白质溶液蛋白质溶液3 3、蛋白质黄色反应、蛋白质黄色反应蛋白质溶液蛋白质溶液 +浓浓HNO3白色沉淀白色沉淀加热加热黄色黄色沉淀沉淀含含Phe、Tyr、Try的的蛋白质所特有的反应蛋白质所特有的反应4、米伦氏反应、米伦氏反应 米米伦伦试剂：硝酸汞试剂：硝酸汞 亚硝酸汞亚硝酸汞 硝酸硝酸 亚硝酸的混合液亚硝酸的混合液 蛋白质溶液加入米伦试剂后即产蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。有此反应。5、乙醛酸反应、乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间出现紫色环。之间出现紫色环。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应。此反应。6、酚试剂（福林试剂）反应、酚试剂（福林试剂）反应 蛋白质一般都含有酪氨酸，而酪蛋白质一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及钨钼酸还原成蓝色化合物（即钼酸及钨钼酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的化合物）。蓝和钨蓝的化合物）。定量测定蛋白质含量。定量测定蛋白质含量。蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应反应名称反应名称试试 剂剂 颜颜 色色反应有关的基反应有关的基团团有此反应的蛋有此反应的蛋白质或氨基酸白质或氨基酸双缩脲双缩脲反应反应加加NaClNaCl及少及少量稀量稀CuSOCuSO4 4紫色紫色粉红色粉红色2 2个以上肽个以上肽键键所有的蛋白所有的蛋白质质米伦反应米伦反应加加HgNOHgNO3 3HgHg（NONO3 3）2 2HNOHNO3 3 共热共热红色红色酚基酚基酪氨酸酪氨酸黄色反应黄色反应浓浓HNOHNO3 3及及NHNH3 3黄色黄色桔色桔色苯基苯基酪氨酸酪氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应反应名称反应名称试试 剂剂颜颜 色色反应有关的基反应有关的基团团有此反应的蛋有此反应的蛋白质或氨基酸白质或氨基酸乙醛酸反应乙醛酸反应乙醛酸试剂乙醛酸试剂及浓及浓H H2 2SOSO4 4紫色紫色吲哚基吲哚基色氨酸色氨酸茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及自由氨基及羧基羧基-氨基酸氨基酸酚试剂反应酚试剂反应碱性碱性CuSOCuSO4 4及磷钨酸及磷钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、酚基、吲哚基吲哚基酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸-萘酚萘酚-次次氯酸盐反应氯酸盐反应-萘酚萘酚次氯酸钠次氯酸钠红色红色胍基胍基精氨酸精氨酸蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收n波长：波长：280nm280nmn引起紫外吸收的因素：主要是酪氨酸和色氨酸引起紫外吸收的因素：主要是酪氨酸和色氨酸(Tyr(Tyr,Trp),Trp)的共轭双键。的共轭双键。n可用于蛋白质的定量分析。可用于蛋白质的定量分析。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱吸收光谱蛋白质的别构作用蛋白质的别构作用n含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功能发生改变的作用称能发生改变的作用称蛋白质的别构作用。蛋白质的别构作用。n因别构而产生的效应因别构而产生的效应称别构效应。称别构效应。正别构效应正别构效应 负别构效应负别构效应酶的别构效应酶的别构效应别构酶别构酶 某些物质能与酶分子上的非催化部位某些物质能与酶分子上的非催化部位特异地结合，使酶蛋白分子构象发生改变，从特异地结合，使酶蛋白分子构象发生改变，从而改变酶的活性，这种现象称为而改变酶的活性，这种现象称为酶的别构调节酶的别构调节。具有这种调节作用的酶，称为具有这种调节作用的酶，称为别构酶别构酶。第六节第六节 蛋白质的提取、蛋白质的提取、分离纯化和测定分离纯化和测定n1 1、生物材料的选择：、生物材料的选择：n2 2、细胞的破碎：、细胞的破碎：n3 3、提取：、提取：n4 4、过滤：、过滤：n5 5、分离：、分离：n6 6、提纯：、提纯：n7 7、测定：、测定：细胞的破碎：细胞的破碎：n机械法：机械法：n高速组织捣碎法高速组织捣碎法n玻璃匀浆器玻璃匀浆器n研磨（加砂）研磨（加砂）n化学及生物化学法：化学及生物化学法：n自溶自溶n溶菌酶处理法溶菌酶处理法n表面活性剂处理法表面活性剂处理法n物理法：物理法：n反复冻融法反复冻融法n冷热交替法冷热交替法n超声波处理法超声波处理法n加压破碎法加压破碎法十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠氯化十二烷基吡啶氯化十二烷基吡啶脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠细胞破碎细胞破碎n如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。释放出来。n动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波等方法动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波等方法破碎。破碎。n植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。n微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。蛋白质的分离纯化和鉴定蛋白质的分离纯化和鉴定n提取提取n分离分离n纯化纯化n鉴定鉴定提取提取n 提提取取通通常常是是指指用用适适当当的的溶溶剂剂和和方方法法，从从原原料料中中把把有有效效成成分分分分离离出出来来的的过过程程。经经过过处处理理和和破破细细胞胞的的原原材材料料中中的的有有效效成成分分，可可用用缓缓冲冲液液，或或稀稀酸酸、稀稀碱碱、有有机机溶溶剂剂（如如丙丙酮酮、乙乙醇醇）等等溶溶液液提提取取。有时还可以用蒸馏水提取。有时还可以用蒸馏水提取。理想的提取溶剂应具备下述条件：理想的提取溶剂应具备下述条件：n对有效成分溶解度大，破坏作用小；对有效成分溶解度大，破坏作用小；n对杂质不溶解或溶解度小；对杂质不溶解或溶解度小；n来源广泛、价格低廉、操作安全等。来源广泛、价格低廉、操作安全等。n一般用缓冲液保持一般用缓冲液保持pHpH。可溶蛋白常用稀盐提取，如。可溶蛋白常用稀盐提取，如NaClNaCl。脂蛋白可用有机溶剂提取，不溶蛋白用稀碱处理。提取脂蛋白可用有机溶剂提取，不溶蛋白用稀碱处理。提取的原则是少量多次。要注意防止植物细胞液泡中的代谢的原则是少量多次。要注意防止植物细胞液泡中的代谢物改变物改变pHpH，可加入碱中和。，可加入碱中和。n为防止酚类氧化可加为防止酚类氧化可加5mMol/L5mMol/L维生素维生素C C。n加入加入SHSH基的保护剂，防其被氧化。基的保护剂，防其被氧化。n加碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。加碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。n加入加入EDTAEDTA，防重金属对蛋白质的破坏。，防重金属对蛋白质的破坏。n低温操作。低温操作。提取 搅拌搅拌n 搅搅拌拌能能促促使使欲欲提提取取物物与与提提取取液液的的接接触触，并并能能增增加加溶溶解解度度。但但是是，一一般般宜宜采采用用温温和和的的搅搅拌拌方方法法，速速度度太太快快时时容容易易产产生生泡泡沫沫，导导致致某某些些酶酶类变性失活。类变性失活。粗提粗提 n主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：n沉淀法沉淀法n分级法：常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白分级法：常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白 n除盐和浓缩除盐和浓缩 分离分离n用适当方法使蛋白用适当方法使蛋白质从提取液中分离质从提取液中分离出来。出来。n分离方法：分离方法：n等电点法等电点法n盐析法盐析法n有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n核酸沉淀剂：核酸沉淀剂：MnClMnCl2 2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等。核酸酶等。n蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDSSDS等，也可除等，也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。的蛋白变性。n选择变性：用加热、调节选择变性：用加热、调节pHpH或变性剂选择性地或变性剂选择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细胞色素变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细胞色素C C时，时，因其稳定性高，可用三氯乙酸处理，使杂蛋因其稳定性高，可用三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。白变性沉淀。沉淀法沉淀法分级法分级法n常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白 n盐析后样品中含大量盐类，用透析除盐析后样品中含大量盐类，用透析除去。也可用分子筛，如去。也可用分子筛，如Saphadex G25Saphadex G25层析除盐。如样品过稀，可用冻干、层析除盐。如样品过稀，可用冻干、超滤等方法浓缩。超滤等方法浓缩。除盐和浓缩除盐和浓缩精制精制 n如需高纯样品，应精制。常用方法有各种层如需高纯样品，应精制。常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。析、电泳、等电聚焦、结晶等。n蛋白结晶不等于无杂质，但变性蛋白不能结蛋白结晶不等于无杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可说明其具有生物活性。晶，所以可说明其具有生物活性。纯化纯化n 从提取液中分离从提取液中分离（沉淀）出来的蛋白（沉淀）出来的蛋白质，仍含有各种各样质，仍含有各种各样的杂质（包括盐类、的杂质（包括盐类、非蛋白质物质和其它非蛋白质物质和其它蛋白质），需要进行蛋白质），需要进行纯化才能达到一定纯纯化才能达到一定纯度。度。n纯化蛋白质的方法：纯化蛋白质的方法：透析法透析法凝胶过滤法凝胶过滤法超滤法超滤法纤维素柱层析法纤维素柱层析法亲和层析法亲和层析法电泳法电泳法超离心法超离心法鉴定鉴定n鉴定蛋白质纯度的方法：鉴定蛋白质纯度的方法：n层析法层析法n电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）参考书：参考书：n生物化学实验原理和方法生物化学实验原理和方法李建武等编，北京李建武等编，北京大学出版社大学出版社n生化技术导论生化技术导论 中山大学生物系生化微生物教中山大学生物系生化微生物教研室编，人民教育出版社研室编，人民教育出版社n生化实验方法和技术生化实验方法和技术张龙翔、张庭芳等编，张龙翔、张庭芳等编，高等教育出版社高等教育出版社n现代生物学技术现代生物学技术张丰德、王秀珍主编，南开张丰德、王秀珍主编，南开大学出版社大学出版社n生物化学生物化学郑集郑集 陈钧辉编著陈钧辉编著 高等教育出版社高等教育出版社实验实验:酸性磷酸脂酶的分离、纯化酸性磷酸脂酶的分离、纯化 操作步骤操作步骤n（一）粗酶液制备（一）粗酶液制备n 将将生生长长5-75-7天天的的绿绿豆豆芽芽去去子子叶叶和和根根，取取茎茎部部，用用蒸蒸馏水冲洗数遍。置吸水纸上吸干表面水分。馏水冲洗数遍。置吸水纸上吸干表面水分。n 准准确确称称取取200200克克，剪剪成成小小段段，置置研研钵钵（或或组组织织捣捣碎碎机机）内内，加加入入少少量量蒸蒸馏馏水水及及少少许许石石英英砂砂，在在冰冰盘盘中中研研磨成匀浆。磨成匀浆。n 匀匀浆浆用用双双层层纱纱布布过过滤滤，去去残残渣渣，滤滤液液静静置置一一小小时时，或或置置冰冰箱箱中中过过夜夜，以以充充分分提提取取。然然后后在在6000rpm6000rpm下下离离心心20-3020-30分分钟钟，弃弃去去沉沉淀淀，取取上上清清液液，并并用用蒸蒸馏馏水水定定溶溶至至200200毫升，置冰箱中备用。毫升，置冰箱中备用。实验实验:酸性磷酸脂酶的分离、纯化酸性磷酸脂酶的分离、纯化 操作步骤操作步骤n（二）硫酸铵分级分离（二）硫酸铵分级分离n 取取上上述述粗粗酶酶液液100100毫毫升升，置置于于烧烧杯杯中中，加加固固体体（NHNH4 4）2 2SOSO4 4使使达达40%40%饱饱和和度度（克克/毫毫升升）。加加硫硫酸酸铵铵时时，应应边边搅搅拌拌，边边缓缓慢慢加加入入，以以防防止止局局部部硫硫酸酸铵铵浓浓度度过过大大而而引引起起酶酶的的变变性性。盐盐析析半半小小时时后后，3000rpm3000rpm离离心心2020分分钟钟，弃弃去去沉沉淀淀，将将上上清清液液倒倒入入量量筒筒中中，量量准准体体积积，然然后后倒倒入入烧烧杯杯中中，加加固固体体硫硫酸酸铵铵至至75%75%饱饱和和度度（克克/毫毫升升），盐盐析析半半小小时时后后，3000rpm3000rpm离离心心2020分分钟钟，弃弃去去上上清清液液，沉沉淀淀用用2020毫毫升升左左右右蒸蒸馏馏水水溶溶解解，置置处处理理好好的的透透析析袋袋中中，悬悬浮浮在在蒸蒸馏馏水水中中在在44下下透透析析2424小小时时（中中间间换换水水2-32-3次次）直直到到用用饱饱和和氯氯化化钡钡溶溶液液检检查查透透析析袋袋外外部部溶溶液液中中硫硫酸酸根根SOSO4 42-2-的的含含量量，无无沉沉淀淀产产生生为为止止，然然后后将将酶酶液液用用蒸蒸馏馏水水稀释到稀释到100100毫升，置冰箱中保存备。毫升，置冰箱中保存备。【目标测试目标测试】1.词解：词解：肽键肽键 多肽多肽 Pr的等电点的等电点 Pr的变性作用的变性作用2.填空：填空：a.开链多肽和开链多肽和Pr分子具有分子具有_末端和末端和_末端。末端。b.Pr分子的二级结构主要是分子的二级结构主要是_和和_结构。结构。c.某某Pr分子的等电点是，置于分子的等电点是，置于PH8.9 的溶液中，的溶液中，该该Pr带带_电荷，电泳时向电荷，电泳时向_极移动。极移动。问题问题A、肽键、肽键B、盐键、盐键C、二硫键、二硫键D、氢键、氢键E、疏水键、疏水键1、蛋白质分子中某些氨基酸的疏水侧链集中可形成、蛋白质分子中某些氨基酸的疏水侧链集中可形成2、蛋白质分子中两个半胱氨酸残基间可形成、蛋白质分子中两个半胱氨酸残基间可形成3、蛋白质分子中稳定、蛋白质分子中稳定-螺旋的键力是螺旋的键力是4、蛋白质完全水解时，分子中何种键断裂、蛋白质完全水解时，分子中何种键断裂问题问题A、-螺旋螺旋B、-片层片层C、亚基、亚基D、氨基酸排列顺序、氨基酸排列顺序E、氢键、氢键1、蛋白质主链构象之一是、蛋白质主链构象之一是2、属于蛋白质一级结构的是、属于蛋白质一级结构的是3、属于蛋白质二级结构的是、属于蛋白质二级结构的是4、属于蛋白质三级结构的是、属于蛋白质三级结构的是问题问题A、破坏蛋白质分子表面的水膜，中和其电荷、破坏蛋白质分子表面的水膜，中和其电荷B、破坏蛋白质的空间构象、破坏蛋白质的空间构象C、两者均有、两者均有D、两者均无、两者均无1、蛋白质变性、蛋白质变性2、蛋白质变性沉淀、蛋白质变性沉淀思考题思考题1 1、某蛋白质分子的等电点是，置于的溶液、某蛋白质分子的等电点是，置于的溶液中，该蛋白质带何种电荷？电泳时向哪中，该蛋白质带何种电荷？电泳时向哪极移动？极移动？2 2、运用所学生化知识简述蛋白质结构与功、运用所学生化知识简述蛋白质结构与功能的关系。能的关系。血浆脂蛋白血浆脂蛋白、概念：血脂与载脂蛋白结合形成的微粒。、概念：血脂与载脂蛋白结合形成的微粒。、组成：载脂蛋白质、组成：载脂蛋白质、TG、PL、Ch、CE、分类：、分类：乳糜微粒乳糜微粒 电泳分类法电泳分类法 前前脂蛋白脂蛋白 脂蛋白脂蛋白 脂蛋白脂蛋白 乳糜微粒乳糜微粒 （CM）极低密度脂蛋白（极低密度脂蛋白（VLDL）密度分类法密度分类法 低密度脂蛋白低密度脂蛋白 （LDL）高密度脂蛋白高密度脂蛋白 （HDL）、组成特点及功能：、组成特点及功能：、组成特点及功能：、组成特点及功能：分类合成部位功能分类合成部位功能CM小肠粘膜细胞转运外源性小肠粘膜细胞转运外源性TG和和Ch到全身到全身VLDL 肝细胞转运内源性肝细胞转运内源性TG到全身到全身LDL 血浆转运内源性血浆转运内源性Ch从肝到全身从肝到全身HDL肝肠转运肝肠转运Ch从肝外组织到肝脏代谢从肝外组织到肝脏代谢教学资源教学资源n教教 材：材：食品生物化学天津轻工业学院、食品生物化学天津轻工业学院、无锡轻工业学院合编，中国轻工业出版社无锡轻工业学院合编，中国轻工业出版社n参考书：参考书：生物化学简明教程聂剑初、吴国利等合编，生物化学简明教程聂剑初、吴国利等合编，高高等教育出版社等教育出版社 生物化学生物化学 周爱儒等主编，人民卫生出版社周爱儒等主编，人民卫生出版社 生物化学郑集生物化学郑集 陈钧辉编著陈钧辉编著 高等教育出版社高等教育出版社 食品生物化学食品生物化学杜克生编著，化学工业出版社杜克生编著，化学工业出版社医学细胞生物学导论余从年医学细胞生物学导论余从年 胡继鹰主编，科胡继鹰主编，科学出版社学出版社一、蛋白质的功能多样性一、蛋白质的功能多样性n1.1.催化功能催化功能 n2.2.结构功能结构功能 n3.3.运输功能运输功能 n4.4.贮存功能贮存功能 n5.5.运动功能运动功能 n6.6.防御功能防御功能 n7.7.调节功能调节功能 n8.8.信息传递功能信息传递功能 n9.9.遗传调控功能遗传调控功能 n10.10.其它排泄功能其它排泄功能 nEdman Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种一种N-N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。端氨基酸残基逐一进行标记和解离。E E E Ed d d dm m m ma a a an n n n氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸顺顺顺顺序序序序分分分分析析析析法法法法