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普通生物化学普通生物化学复习用复习用 第一篇蛋白质 核酸 和遗传的分子机理（21时）Part I Nucleic Acids and The Genetic Molecular Mechanism (1-7Chapter )普通生物化学普通生物化学-2-2Ch1 Ch1 蛋白质蛋白质 Proteins Proteins 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成1.2蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构2.1.3蛋白质结构与功能的关蛋白质结构与功能的关系系3.4蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及其分离纯化及其分离纯化 碳碳(C)50%55%氢氢(H)6%8%氧氧(O)19%24%氮氮(N)13%19%16%；N(g)6.25=样品样品Pr含量含量硫硫(S)0%4%少量的少量的磷磷(P)铁铁(Fe)铜铜(Cu)锌锌(Zn)和碘和碘(I)等等1.1 1.1 蛋白质蛋白质(protein)的化学组成的化学组成元素组成元素组成元元素素组组成成CRH2NHCOOHCRH3N+HCOO-或1.1.2基本组成单位-氨基酸amino acids氨氨基基酸酸结结构构通通式式氨基酸的立体异构氨基酸的立体异构Amino Acid Stereoisomers 构成蛋白质的构成蛋白质的20种氨基酸种氨基酸(aa)的结构特点的结构特点:均为均为L氨基酸，各种氨基酸，各种aa的的R侧链各不相同侧链各不相同碳原子上均连有一个氨基碳原子上均连有一个氨基(脯氨酸脯氨酸除外除外)-碳原子为不对称碳原子为不对称(手性手性)碳原子碳原子(甘氨酸甘氨酸除外）除外）#1非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸#2极性中性氨基酸极性中性氨基酸#3酸性氨基酸酸性氨基酸#4碱性氨基酸碱性氨基酸氨基酸的种类氨基酸的种类 Amino Acid Classes Amino Acid Classes 从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种根据氨基酸侧链基团根据氨基酸侧链基团()的结构和理化性质，将其的结构和理化性质，将其分为分为4 4类：类：#1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸Modified Amino Acids 包括包括7个：个：甘氨酸（甘氨酸（Gly-G）丙氨酸（丙氨酸（Ala-A）缬氨酸（缬氨酸（Val-V）亮氨酸（）亮氨酸（Leu-L）异亮氨酸）异亮氨酸（Ile-I）苯丙氨酸（）苯丙氨酸（Phe-F）脯氨酸（）脯氨酸（Pro-P）Figure 3.9.Cyclic Structure of Proline.The side chain is joined to both the-carbon and the amino group.Pro(proline)晡晡 differ from others in that its side chain is bonded to both the nitrogen and the-carbon atom其侧链其侧链(除同除同-碳原子外碳原子外)还同还同(氨基氨基)氮原子成氮原子成键键(形成吡咯环形成吡咯环),因此因此,它只是它只是-亚亚AA(而不是真正意义上的而不是真正意义上的-AA)#2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸R-基含有基含有极性基团；极性基团；酪氨酸酪氨酸(Tyr-YTyr-Y)生理生理pH条件下不解离。条件下不解离。色氨酸色氨酸(Trp-WTrp-W)、丝氨酸丝氨酸(Ser-SSer-S)、半胱氨酸半胱氨酸(Cys-CCys-C)、蛋氨酸蛋氨酸(Met-MMet-M)、天冬酰胺天冬酰胺(Asn-NAsn-N)、谷氨酰胺谷氨酰胺(Gln-QGln-Q)、苏氨酸苏氨酸(Thr-TThr-T)、包括包括8个：个：Figure 3.10.Amino Acids with Aromatic Side Chains.具有芳香族侧链的氨基酸 Three AA with aromatic si e:Phe(phenylalanine)苯丙苯丙,Tyr(tyrosine),酪酪 with a reactive hydroxyl group,Trp(tryptophan)色具吲哚环色具吲哚环.Phe and Trp are highly hydrophobic#3.酸性氨基酸酸性氨基酸R-基有基有COOH(COO-)带负电荷带负电荷谷氨酸谷氨酸 Glu-G Glu-G天冬氨酸 Asp-D#4.碱性氨基酸碱性氨基酸R-基有基有-NH2(NH3+)赖氨酸赖氨酸Lys-k精氨酸精氨酸Arg-R组氨酸组氨酸His-H带正电荷带正电荷 构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸结构式：种氨基酸结构式：人体所需的八种必需氨基酸人体所需的八种必需氨基酸 赖氨酸赖氨酸(Lys)(Lys)缬氨酸缬氨酸(Val)(Val)蛋氨酸蛋氨酸(Met)(Met)色氨酸色氨酸(Try)(Try)亮氨酸亮氨酸(Leu)(Leu)异亮氨酸异亮氨酸(Ile)(Ile)酪氨酸酪氨酸(Thr)(Thr)苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)(Phe)婴儿时期所需婴儿时期所需:精氨酸精氨酸(Arg)(Arg)、组氨酸、组氨酸(His)(His)早产儿所需：色氨酸早产儿所需：色氨酸(Try)(Try)、半胱氨酸、半胱氨酸(Cys)(Cys)几种重要的不常见氨基酸几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下#1两性解离及等电点两性解离及等电点1.1.2.3氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质Amino Acid Reactions+OH+H+OH+H+pHpIpH=pI等电点等电点(pI)：氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，分子所带的净电荷为零，此时溶液的分子所带的净电荷为零，此时溶液的pH值就值就称为该氨基酸的等电点。称为该氨基酸的等电点。除碱性氨基酸外，其余氨基酸的等电点均除碱性氨基酸外，其余氨基酸的等电点均小于小于pH7pI=1/2（pK1+pK2）若一个若一个aa有有3个解离基因，则其个解离基因，则其pI为兼性离子为兼性离子两边两边pK的平均值的平均值#2紫外吸收性质紫外吸收性质芳香族氨基酸色氨芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸在酸和酪氨酸在280nm波波苯丙氨酸苯丙氨酸长附近对紫外长附近对紫外光有最大吸收峰。光有最大吸收峰。蛋白质均含上述氨蛋白质均含上述氨基酸，故也具紫外吸收基酸，故也具紫外吸收性。据此可以通过测定性。据此可以通过测定蛋白质溶液蛋白质溶液280nm的吸的吸光值快速测定其蛋白质光值快速测定其蛋白质含量。含量。#3茚三酮反应茚三酮反应aa与水合茚三酮一起加热，与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化合物，在生成蓝紫色的化合物，在570nm处有最大吸收。据此处有最大吸收。据此亦可用作亦可用作aa含量分析。含量分析。1.2.1肽键肽键脱去一分子水缩合形成的键脱去一分子水缩合形成的键肽肽Peptides 一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基与羧基与另一个氨基酸的另一个氨基酸的-氨基氨基肽键的概念：肽键的概念：称称肽键肽键peptidebondCOHOCH3NH2HC+HOCOCH2NH2HC丙氨酸丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸COHOCH3HCCH2NH2HC肽键肽键NCOH二肽二肽丙苯氨丙氨酸丙苯氨丙氨酸1.2.2肽肽Peptides 氨基酸借肽键相连而形成的化合物称氨基酸借肽键相连而形成的化合物称肽肽(peptide)Met Phe二肽二肽LysMet Phe三肽三肽CysThrLysMet Phe五肽五肽寡肽寡肽(oligopeptide)由由10个以内氨基酸连成的小肽个以内氨基酸连成的小肽多肽多肽(polypeptide)由许多氨基酸连成的肽由许多氨基酸连成的肽又称多肽链或肽链又称多肽链或肽链其形状为一条没有分支的长链，其形状为一条没有分支的长链，氨基末端氨基末端(端端)羧基末端羧基末端(C端端)CysMet PheLysSerThrValNH2COOH氨基酸在形成肽链时丢失了一分子水，氨基酸在形成肽链时丢失了一分子水，肽链中的氨基酸分子已不完整，称为肽链中的氨基酸分子已不完整，称为氨氨基酸残基基酸残基(aminoacidresidue)。氨基酸残基氨基酸残基:蛋白质与多肽的区别：蛋白质与多肽的区别：Protein空间构象相对稳定空间构象相对稳定氨基酸残基数较多氨基酸残基数较多Peptide空间构象不稳定空间构象不稳定 氨基酸残基数较少氨基酸残基数较少生物活性肽生物活性肽1.2.4.1谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione，GSH)构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的r羧基羧基由谷氨酸由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸和甘氨酸(Gly)组成的三肽组成的三肽GluCysGly#1组成组成#2功能功能GSH是体内重要的还原剂是体内重要的还原剂由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素甲状腺素(调节糖代谢调节糖代谢)。促甲状腺素释放激素促甲状腺素释放激素#1组成组成pyro-GluHisPro-NH2#2功能功能焦谷氨酸焦谷氨酸组氨酸组氨酸脯氨酰胺脯氨酰胺蛋白质的分类蛋白质的分类根据组成成分分为：根据组成成分分为：单纯蛋白质单纯蛋白质全部由全部由aa组成；组成；结合蛋白质结合蛋白质除蛋白部分外，除蛋白部分外，还含非蛋白部分。还含非蛋白部分。结合蛋白质中的非蛋白部分称为结合蛋白质中的非蛋白部分称为辅基辅基，常以共价键与蛋白部分相连。常以共价键与蛋白部分相连。辅基辅基：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属离子乃至核酸等离子乃至核酸等第四节第四节蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及其分离纯化及其分离纯化一一、蛋白质的理化性质、蛋白质的理化性质（一）两性解离和等电点（一）两性解离和等电点蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的主要取决于溶液的pH值。值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H+OH-+H+pH=pIpHpI此时溶液的此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点值称为蛋白质的等电点(pI)。等电点（等电点（pI）：）：在某一在某一pH值溶液中，值溶液中，蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质分子颗粒大小蛋白质分子颗粒大小1100nm之间之间,属胶属胶体颗粒范围，体颗粒范围，蛋白质的胶体原因：蛋白质的胶体原因：表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷的斥力表面同种电荷的斥力（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质在溶液中能形成稳定的胶体在溶液中能形成稳定的胶体常见的变性因素：常见的变性因素：强酸、强酸、强碱、强碱、有机溶剂、有机溶剂、尿素、尿素、胍、胍、重金属重金属生物碱、生物碱、化学因素化学因素物理因素物理因素剧烈振荡剧烈振荡热、热、紫外线、紫外线、超声波、超声波、变性蛋白质的主要特征变性蛋白质的主要特征:一级结构不变。一级结构不变。（2）生物活性丧失。生物活性丧失。粘度增加而扩散系数减小。粘度增加而扩散系数减小。（4）变性蛋白质容易消化变性蛋白质容易消化。（1）蛋白质分子中的次级键断裂，）蛋白质分子中的次级键断裂，（3）变性蛋白质的溶解度常降低、变性蛋白质的溶解度常降低、构象破坏，但不涉及共价键的破坏，构象破坏，但不涉及共价键的破坏，除去变性因素后，有的变性蛋白质又可除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性称为蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation)当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为出，这种现象称为蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀。2.蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀(pre-cipitation)概念概念:应用应用:(1)蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化(2)解毒解毒(3)临床检验临床检验(2)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层使蛋白质脱去水化层,又能降低溶又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。必须在低温下操作必须在低温下操作注意事项注意事项:尽量缩短处理的时间尽量缩短处理的时间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇甲醇、乙醇乙醇、丙酮丙酮缺点：缺点：原理原理:常用有机溶剂常用有机溶剂:常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性重金属离子如重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀性的重金属蛋白盐而沉淀。(3)重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性失活。此法常使蛋白质变性失活。若溶液若溶液pH大于蛋白质的大于蛋白质的pI，沉淀更易发生，沉淀更易发生缺点：缺点：原理原理:生生物物碱碱试试剂剂(如如鞣鞣酸酸、苦苦味味酸酸、钨钨酸酸等等)，某某些些酸酸类类(主主要要是是指指三三氯氯醋醋酸酸、磺磺酰酰水水杨杨酸酸和和硝硝酸酸等等)，与与带带正正电电的的蛋蛋白白质质结结合合生成不溶性的盐而沉淀。生成不溶性的盐而沉淀。(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的反应溶液的pHpI，确保蛋，确保蛋白质以阳离子形式存在白质以阳离子形式存在缺点：缺点：原理原理:常引起蛋白质变性常引起蛋白质变性注意事项注意事项:3.蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果。性后进一步发展的不可逆结果。如加热可使蛋白质变为不容再溶如加热可使蛋白质变为不容再溶解的凝块。解的凝块。多肽链中氨基酸的顺序分析多肽链中氨基酸的顺序分析第一步：第一步：分离提纯蛋白质分离提纯蛋白质，测定，测定NH2末端的数末端的数目，确定蛋白质分子是目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的，并分由几条肽链构成的，并分离出离出每条肽链。测定肽链的分子量每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该计算组成该肽链的氨基酸残基数。肽链的氨基酸残基数。及每种及每种aa的百分组成。的百分组成。一般过程：一般过程：肽链分子中氨基酸残基数肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量肽链的分子量120（各种的氨基酸残基的平均分子量为（各种的氨基酸残基的平均分子量为120）再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨基酸分离。的氨基酸分离。a.丹磺酰氯法丹磺酰氯法丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链地与链N-端端-氨基反应生成丹磺酰氨基反应生成丹磺酰-肽，肽，后者水解生成的丹磺酰后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出出N-端是何种氨基酸。端是何种氨基酸。第二步第二步测定肽链的氨基末端和羧基末端测定肽链的氨基末端和羧基末端1.N末端的测定末端的测定b.二硝基苯氟法二硝基苯氟法：过时，不用过时，不用2.C末端的测定末端的测定常用羧基肽酶法常用羧基肽酶法羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，分别进行顺序分析。分别进行顺序分析。第一篇第一篇 遗传的物质基础遗传的物质基础-核酸核酸遗传的分子基础遗传的分子基础基因与基因组学基因与基因组学分子杂交与分子杂交与PCRPCR技术技术第三步第三步肽链的局部水解肽链的局部水解胰蛋白酶的作用原理胰蛋白酶的作用原理1.酶解法酶解法1.1 遗传的分子基础遗传的分子基础 DNA(Deoxyribonucleic Acid)-主要的主要的遗传物物质 RNA(Ribonucleic Acid)-某些原核生物的某些原核生物的遗传物物质 DNA RNA 蛋白质蛋白质(Protein)-基因的原初表达基因的原初表达CNBr与Met反应测定Pr的一级结构2.化学法化学法Edman降解法的示意图降解法的示意图一般常用多种方法使肽链断裂，一般常用多种方法使肽链断裂，并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由于在不同部位断链，只要找出多套肽于在不同部位断链，只要找出多套肽段的重叠部位，然后组合排列对比，段的重叠部位，然后组合排列对比，即可推断肽段的排列顺序，从而得出即可推断肽段的排列顺序，从而得出完整肽链中氨基酸的顺序。完整肽链中氨基酸的顺序。第五步第五步肽链一级结构的确定肽链一级结构的确定则其氨基酸排列顺序为：则其氨基酸排列顺序为：Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如测一个九肽如测一个九肽测得测得N端氨基酸残基为端氨基酸残基为Thr又分别测得片断又分别测得片断:Ala-Ala-Trp-Gly-LysVal-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白质的氨基酸顺序质的氨基酸顺序1.1.1 DNA的化学与生物学的化学与生物学 组成组成 一一级结构构 二级结构二级结构 超螺旋结构超螺旋结构 DNA分子分子的组成的组成 基本基本组成成单位：核苷酸位：核苷酸N-糖苷键糖苷键磷酸酯键磷酸酯键N-糖苷键糖苷键磷酸酯键磷酸酯键磷酸酯键磷酸酯键德国科学家用核酸水解实验德国科学家用核酸水解实验证明了核酸的组成成分证明了核酸的组成成分,为此为此获得了获得了1910年诺贝尔生理及医年诺贝尔生理及医学奖。学奖。