碱性磷酸酶比活力测定.ppt
碱性磷酸酶比活力的测定碱性磷酸酶比活力的测定2.2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法掌握碱性磷酸酶比活测定的方法一、目的要求二、原理二、原理（一）、比色分析法（一）、比色分析法光的互补示意图光的互补示意图1.物质的颜色和波长：物质的颜色和波长：可见光：波长（可见光：波长（）400760nm紫外光：紫外光：小于小于400nm红外光：红外光：大于大于760nm2.溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。3.物质浓度，液层厚度与光吸收的关系物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert-Beer定律）：定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（与溶液的浓度（C），），液层的厚（液层的厚（L）以及入射光的强度以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。律。4.待测溶液浓度的计算：待测溶液浓度的计算：（1 1）标准管法：）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D D）值，然后计算：值，然后计算：C C未知未知=（D D未知未知/D D标准标准）C C标准标准（2 2）标准曲线法：）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D D）值。值。在一定浓度范围内，溶液浓度（在一定浓度范围内，溶液浓度（C C）与其光密度（与其光密度（D D）之之间呈直线关系。以各管间呈直线关系。以各管D D为纵坐标，为纵坐标，C C为横坐标，绘制标为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液准曲线。待测溶液D D值测出后，在曲线上查出值测出后，在曲线上查出C C。1%1%浓度，浓度，1 1cmcm厚度溶液中测得：厚度溶液中测得：K=E1cm1%K=E1cm1%或克分子浓度，或克分子浓度，cmcm厚度溶液中测得：厚度溶液中测得：K=K=C=D/E1cm%,C=D/E1cm%,或或 C=D/C=D/常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在别在280280nmnm和和260260nmnm处有最大吸收，其消光系数可查处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度,带入带入上式即可求得上式即可求得C C。（3 3）消光系数法：）消光系数法：（二）、酶活力（二）、酶活力在在37 C下，以下，以5mmol/L pNPP为底物，在的碳酸为底物，在的碳酸盐缓冲液含盐缓冲液含2 mmol/L MgMg2+2+的测活体系中每分钟催的测活体系中每分钟催化产生化产生1 1 mol/L pNPmol/L pNP的酶量定为的酶量定为1个酶活力单位。个酶活力单位。酶的比活力定义为每酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位蛋白所具有的酶活力单位数。数。酶活性测定前处理酶活性测定前处理1、2号样品稀释号样品稀释50倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释）4号样品不稀释（用洗脱液稀释）号样品不稀释（用洗脱液稀释）蛋白浓度测定前处理蛋白浓度测定前处理1、2号样品稀释号样品稀释100倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释）4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）12支试管，支试管，1-4做两组平行测定管，做两组平行测定管，01-04作为空白对照作为空白对照管管 号号空白空白（01-04）1-12-23-34-45 mM pNPP(mL)各各0.2mL Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2(mL)各管加入各管加入0.2 mL H2O(mL)各各0.50mL混匀，混匀，37，5分钟分钟 酶酶液（液（mL）/各各0.1mL37，精确反应，精确反应10分钟分钟 0.1 mol/L NaOH(mL)各管加入各管加入2.0 mL 酶液（酶液（mL）0.1mL OD 405 nm蛋白浓度测定蛋白浓度测定1.测定测定100 g/mL牛血清白蛋白溶液的牛血清白蛋白溶液的OD值值；2.将稀释后的样品在将稀释后的样品在280nm下测定吸光度；下测定吸光度；3.以洗脱液作空白。以洗脱液作空白。蛋白浓度按下式计算：蛋白浓度按下式计算：数据处理数据处理mL酶液催化产物量计算：酶液催化产物量计算：克分子消光系数法克分子消光系数法即即C未知103)计算：式中：A为稀释倍数，B为由消光系数法计算得的pNP mol数，t为反应时间，C为测得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg）酶活力(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力 100/第一步总活力 A
