胚胎试验在水生动物中的应用.ppt

胚胎试验在水生动物中的应用李康建立灵敏、简便易行的检测方法急性暴露试验虽然简便易行，但是其检测指标过于简单。各种慢性毒性试验虽然提供多个检测终点，但存在实验周期长、费用高等不足。而水生生物胚胎试验具有成本低、影响因素少、灵敏度高等方面的优势，受试物种也由最初的鱼类向多样化发展，其应用日益广泛。鱼类成体和胚胎试验灵敏度比较胚胎试验胚胎试验是又称胚胎毒性试验或胚胎致畸试验，指通过把胚胎暴露于受试化学物质而受到毒害作用，继而影响胚胎的发育、导致胚胎发育停滞或胚胎畸形。广义上的胚胎试验包括所有以胚胎为材料的生物学试验，其内容涵盖形态学、发育学、毒理学、行为学等方面。鱼类 鱼类因具有繁殖力高、体外产卵、体外受精等生殖特性成为胚胎试验的最主要材料。用于胚胎试验的一些种类斑马鱼 在实验室内对单一物质的毒性评价往往使用特定的种类，斑马鱼是其中一个重要代表。欧洲和美国都有已经建立的标准方法。Zebrafish(Danio rerio)甲壳类 草虾草虾属广盐性甲壳动物(3-31ppt)。分布广(遍布美国东海岸和墨西哥湾的广大河口)。个体小，只要水温，光照条件适宜，成体在实验室容易繁殖，只需分离不同发育阶段的胚胎即可用于试验。尽管雌体产卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎离体后同样可以正常发育至孵化，卵外被膜、胚胎透明而易于观察形态异常。Grass shrimp(Palaemonetes pugio)Grass shrimp(Palaemonetes pugio)其它动物The Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus(FETAX)爪蟾ASTM E 1563-98:Standard guide for Conducting Static Acute toscicity Tests with Echinoid Embryos 海胆 Medaka(Oryzias latipes)Blue crab(Callinectes sapidus)试验动物的选取被广泛利用在实验室内容易大量培养具有代表性和对受试物的敏感性遗传背景清楚 试验动物的饲养也有相应的规范胚胎来源 多数鱼类产卵后离体孵化，易于收集。一般可采用亲鱼人工催产结合人工受精的方法获得。对于如斑马鱼，青鳉等小型种类，在实验室内养殖相对容易，只需控制适当的物理条件，一般都能在试验当天取到足够数量的受精卵。野外试验收集鱼卵 在实验室完成剩余的发育过程，检测多个终点指标。原位暴露 在室内得到受精卵，用适当的装置放置于待检测的地点，全部发育过程或绝大部分发育过程在野外完成。有抱卵习性的甲壳动物，胚胎在母体腹部附肢发育成幼体，通过捕捞带卵的母体，分离胚胎。分类胚胎试验同样可分成急性毒性试验和亚急性毒性试验。急性毒性试验时间较短，其目的是获得有关受试物的初步毒性信息；亚急性毒性试验时间较长，可以贯穿胚胎发育的整个时期。暴露途径 可分为静态，半静态和流动等，或微注射的途径。容器透明的试验容器通常是首选，烧杯、培养皿、培养管是最普通的工具。在野外暴露试验中，有黏性的受精卵可以被直接负在载玻片上，后者固定在特制的容器里。溶剂有机物质水溶性较差，则需要化学溶剂来助溶，但不适当的溶剂会影响结果的可靠性，化学溶剂本身对胚胎具有毒性甚至会和受试物产生协同作用，因此，选用适当的溶剂以及适当的浓度对结果的准确性都是有益的。乙醇，丙酮，二甲亚砜是常用的溶剂，终浓度一般在0.1%以下。0.5%(V/V)乙醇1%(V/V)乙醇对照Grass shrimp(Palaemonetes pugio)检测终点半致死浓度（LC50）形态异常孵化延迟生化指标遗传物质生长指标半致死浓度（LC50）半致死浓度（LC50）死亡是检测的可见终点，初步反映受试物的毒性，是急性毒性试验的常用指标。孵化也可作为终点来反映受试物毒性，指标采用半效应浓度（EC50）。在发育早期可以胚胎完整性来判断存活与否，当器官出现后则用器官的运动作为标准。形态异常 形态异常是胚胎致畸试验的核心内容。斑马鱼和爪蟾胚胎发育过程中有多种可以观察的反应指标，被列入标准方法的观察终点。对于甲壳动物，常见的观察结构有眼、卵黄形状、心脏、头部、肝胰腺。发育异常往往会导致导致终止发育或发育延迟，进而推迟孵化时间。B=brain;C=chorda;Ch=chorion;E=ear;Ed=edema;Eud=ear underdeveloped;Ey=eye;Eyud=eye underdeveloped;NC=negative control;Tnd=tail not detached;woEy=without eyes;woH=without head;woS=without somitesCatfish(Clarias gariepinus)对照 Cd 和Cu1%(V/V)乙醇对照Grass shrimp(Palaemonetes pugio)孵化延迟Grass shrimp(Palaemonetes pugio)生化指标 随着胚胎发育的深入，器官逐渐建成，一些酶活性也显示出来，在暴露条件下酶活性的改变也可作为检测终点；受试物既可抑制酶活性，也可使一些酶出现应激性增强。Grass shrimp(Palaemonetes pugio)受试物及其代谢物还可能对遗传物质产生影响 Grass shrimp(Palaemonetes pugio)生长指标Catfish(Clarias gariepinus)Pacfic herring(Clupea pallasi)应用现状 单一化学品毒性环境检测项目 检测土壤、沉积物污染。石油降解产物；溢油事件的生态恢复研究。混合性工业生产废水，生活污水的毒性，特别是致畸效应，被用于探讨遗传毒性。发展前景 尽管胚胎试验有着高重复性的优点，但试验材料和检测指标的选取都会影响到试验的结果。不同发育阶段的材料应选取适当的指标，因不同发育阶段的胚胎对同一毒物具有不同的敏感度。各国研究者正在进一步建立和完善针对更多的试验材料的胚胎试验，以满足各种生态环境的评估。随着多学科专业相互渗透的加深，工具日益完善，高通量筛选成为可能，使得应用前景更广泛。实验材料终点方法谢谢Catfish(Clarias gariepinus)