生物分离工程第二章细胞破碎.ppt

生物工程下游技术生物工程下游技术第二章第二章 细胞分离与破碎细胞分离与破碎3 3 学时学时学习目的和要求学习目的和要求掌握解掌握解细胞分离细胞分离和和目标产物目标产物的释放的的释放的原理原理和方法，熟知各种方法的和方法，熟知各种方法的优缺点优缺点和应用范围。和应用范围。目录目录n一、细胞分离一、细胞分离n（一）、重力沉降（一）、重力沉降n（二）、离心沉降（二）、离心沉降n（三）、过滤（三）、过滤n二、细胞破碎与胞内物释放二、细胞破碎与胞内物释放细胞分离学习要点细胞分离学习要点n识记：识记：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。重力沉降、离心沉降和过滤的概念。n理理解解：重重力力沉沉降降、离离心心分分离离与与过过滤滤原原理理、理理论；掌握论；掌握StokesStokes（斯托克斯）沉降公式（斯托克斯）沉降公式。n应用：应用：常用离心方法及优缺点；利用掌握的常用离心方法及优缺点；利用掌握的提高分离效率的方法分析决实际问题提高分离效率的方法分析决实际问题（一）、重力沉淀n1、重力沉淀的定义n2、重力沉淀的理论n3 3、提高重力沉降的途径、提高重力沉降的途径1、重力沉降定义、重力沉降定义重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。重力沉降重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差，是利用流体与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。相对运动，从而实现两者的分离。在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞碎片等有形物碎片等有形物千姿百态的微生物世界千姿百态的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture2、重力沉降理论、重力沉降理论n理论假设理论假设n细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；n颗颗粒粒在在无无限限稀稀释释的的溶溶液液中中进进行行沉沉降降，颗颗粒粒之间无相互干扰之间无相互干扰 n受力分析受力分析球形颗粒重力球形颗粒重力fg 液体的浮力液体的浮力fb 颗粒运动方向相反的阻力颗粒运动方向相反的阻力 fsFsd=2R球形颗粒沉降的受力情况球形颗粒沉降的受力情况重力沉降理论重力沉降理论重力：重力：浮力：浮力：阻力：阻力：d,Ps分别指颗粒的直径（m）和密度（）重力沉降理论重力沉降理论当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，达到平衡时，则则重力沉降理论重力沉降理论当球形颗粒处于滞流区（当球形颗粒处于滞流区（）时）时 Stokes公式公式当球形颗粒处于过渡区（当球形颗粒处于过渡区（）时）时 Allen公式公式当球形颗粒处于湍流区（当球形颗粒处于湍流区（）时）时Newton公式公式千姿百态的微生物世界千姿百态的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture球形颗粒？无限稀释溶液？无限稀释溶液？3 3、提高重力沉降的途径、提高重力沉降的途径n加入中性盐：双电层排斥电位降低双电层排斥电位降低n加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大架桥作用形成大絮凝图絮凝图n引入外力引入外力（二）、离心沉淀n1、离心沉淀的定义n2、离心沉淀的理论n3、离心分离方法n4、离心分离设备1、离心沉降定义、离心沉降定义离心沉降离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。生相对运动，从而使颗粒和流体分离。2、离心沉降理论、离心沉降理论离心沉降速度离心沉降速度 令：令：3、离心分离方法、离心分离方法n差速离心分级差速离心分级n区带离心区带离心 差速区带离心差速区带离心 平衡区带离心平衡区带离心 差速离心分离差速离心分离 差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。差速离心分离应用实例差速离心分离应用实例600g10 min15000g10 min100000g60 min300000g120 minnucleiMitochondrialysosomesPlasma membraneRiosomal subunitshomogenateFiltered homogenateSoluble part of cytoplasmSedimentation区带离心分离前提区带离心分离前提 在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。操作过程操作过程区带离心种类区带离心种类n差速区带离心(速度区带离心）n平衡区带离心（等密度离心）差差速速区区带带离离心心差速区带离心差速区带离心n基于颗粒的大小、形状的分离n梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度n离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等n动态离心分离方法平平衡衡区区带带离离心心平衡区带离心平衡区带离心n梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度n离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等n平衡离心分离方法梯度液的种类和应用梯度液的种类和应用细胞分离区带离心异同细胞分离区带离心异同区带离心种类区带离心种类差速区带离心差速区带离心平衡区带离心平衡区带离心共同点共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用氯化铯常用氯化铯密度梯度密度梯度最最大大的的密密度度梯梯度度低低于于最最大大密密度的沉降样品度的沉降样品最最大大的的密密度度梯梯度度大大于于最最大大密密度的沉降样品度的沉降样品区带形成条件区带形成条件根根据据各各个个组组分分沉沉降降系系数数的的差差别，形成各自的区带别，形成各自的区带根据各组分密度差形成区带根据各组分密度差形成区带离心条件离心条件在在最最前前的的沉沉降降物物质质达达到到管管底底前停止，短时间，低速度前停止，短时间，低速度使使各各组组分分沉沉降降到到其其平平衡衡的的密密度区，长时间，高速度度区，长时间，高速度离心方法新进展具体表现离心方法新进展具体表现在哪几个方面？在哪几个方面？n1.固定角固定角转子垂直管离心法的子垂直管离心法的进展展n使用垂直管转子的成功之例是1980年由B.H.Chung等提高的血清脂蛋r白分离的SVs方法(即Single Vertical Spin法,一单次垂直管离心法)，它使对临床诊断意义很大的这一分离在实用上成为可能.传统的血清脂蛋白分离用“顺序浮选法”(即SF法)，一次分离需时3天，用去驱动寿命1亿转以上。现用垂直管转子作SVS方法，不连续NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，万一万转/分，0.75-2.5 i)时，一次分离成功。n3.短液柱离心法短液柱离心法(Short-Columnmethod)n由美国的0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平转子中人为地使用不加满的离心管来降低液柱高。此法不仅降低液柱高以减少离心时间，更重要的是使处千液面的样品受到更大的离心力从而进一步缩短了离心时间，在不减少样品量和样品浓度的条件下，可把离心时间缩短为常规满管离心时的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它们在不加满离心时也不会变形。n4.细绝(或或细菌菌)的离心洗脱的离心洗脱(Flutriator)技技术n 这是美国Beckman公司近年发展的一种低速连续洗脱技术，特别适用于培养液的连续收集。使用的是带小容量连续离心池的JE-6B转子.其洗脱原理不是在一般转子中的沉降，而是被分离物在离心中的“浮选”。用4.2ml的离心池可在1小时内从100-1 000m!的原液中回收10-10，个细胞。n2.超速超速连续离心法离心法n超速连续离心转子是由美国Beckman公司开发的，最适用于病毒的纯化，从大量的组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中细菌的收集，以及污水研究。4、离心设备分类、离心设备分类分类方法分类方法名称名称处理量处理量实验室用离心机，工业用离心机实验室用离心机，工业用离心机温度温度常温离心机、冷冻离心机常温离心机、冷冻离心机转速转速低速离心机、高速离心机、超速离心机低速离心机、高速离心机、超速离心机转子结构转子结构管式、碟式管式、碟式常用离心设备常用离心设备Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation 常用离心设备常用离心设备Decanter centrifuge Multichamber bowl,vertical cut 管式离心设备管式离心设备A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraperTubularbowl碟片离心设备碟片离心设备(a)Solids-retaining disk bowl,(b)Radial solids-ejecting disk bowl,top feed.(c)Radial solids-ejecting disk bowl,hermetic feed.(d)Axial solids-ejecting disk bowl.(e)Nozzle bowl with pressurized solids discharge.(f)Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.离心设备比较离心设备比较管式离心机管式离心机优点优点结构简单，转速和离心力较大结构简单，转速和离心力较大缺点缺点沉降面积小、处理能力低；沉降面积小、处理能力低；碟式离心机碟式离心机优点优点转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大缺点缺点结构复杂、转速较低；结构复杂、转速较低；离心机处理能力离心机处理能力粒子在径向上的沉降速度粒子在径向上的沉降速度 轴向移动速度轴向移动速度 完全沉降的边界条件完全沉降的边界条件 离心机处理能力离心机处理能力影响因素影响因素处理样品的特性，如密度、粒径等处理样品的特性，如密度、粒径等溶液的特性，如密度、粘度等溶液的特性，如密度、粘度等离心机机械结构，如离心机机械结构，如r1和和r2操作条件，操作条件，（三）、过滤n1、过滤的定义n2、过滤的受力分析n3、提高过滤速度的途径1、过滤定义、过滤定义过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。离的方法。过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一种常备的分离方法。一种常备的分离方法。2、过滤过程受力分析、过滤过程受力分析推动力：推动力：过滤操作以压力差为主要推动力；过滤操作以压力差为主要推动力；阻阻 力：力：过滤过程的阻力来自多孔性过滤介过滤过程的阻力来自多孔性过滤介 质和介质表面不断堆积形成的滤饼质和介质表面不断堆积形成的滤饼 过滤速率过滤速率Q：液体的流量：液体的流量A:面积面积Rm表示介质的阻力；表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；表示滤饼的阻力；L为滤液的粘度为滤液的粘度恒压过滤方程恒压过滤方程Ruth恒压过滤方程恒压过滤方程其中，其中，K为为Ruth恒压过滤系数，表示为恒压过滤系数，表示为3、提高过滤速度的途径提高过滤速度的途径n采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液的性质，降低滤饼阻力的性质，降低滤饼阻力n加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，提高过滤速度提高过滤速度滤饼滤饼传统的过滤cakeConventionalfiltration二、细胞破碎与胞内物释放二、细胞破碎与胞内物释放n1、概述n2、细胞破碎技术的分类n3、常用破碎方法的介绍学习要点学习要点n理理解解：各各种种细细胞胞破破碎碎方方法法原原理理、优优缺缺点点及其适用范围。及其适用范围。n应用：应用：采用不同的细胞破碎方法对不同采用不同的细胞破碎方法对不同细胞进行不同程度的破碎。细胞进行不同程度的破碎。1、概述n（1）细胞结构n（2）细胞膜的组成n（3）影响产物释放的因素（1）细胞结构）细胞结构（真核细胞与原核细胞）（真核细胞与原核细胞）动物细胞动物细胞没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜植物细胞植物细胞细胞膜外有一层坚固的细胞壁细胞膜外有一层坚固的细胞壁酵母细胞酵母细胞细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加难以破碎细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加难以破碎真核细胞真核细胞原核细胞原核细胞革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌细细胞胞壁壁由由肽肽聚聚糖糖层层组组成成，壁壁厚厚约约1550nm，肽肽聚聚糖糖含含量量为为4090%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌细细胞胞壁壁在在肽肽聚聚糖糖的的外外侧侧还还有有分分别别由由（1）脂脂蛋蛋白白和和（2）磷磷脂脂和和脂脂多多糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越810nm。（2）细胞膜组成）细胞膜组成（A）（B）（3）影响产物释放的环境因素）影响产物释放的环境因素在在复复杂杂培培养养基基中中生生长长的的大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞其其破破碎碎较较单单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；对数对数生长期生长期的细胞会表现得更加脆弱。的细胞会表现得更加脆弱。从从连连续续培培养养过过程程中中获获得得的的、具具有有较较高高比比生生长长速速率率的的念念珠珠菌菌的的细细胞胞壁壁更更加加脆脆弱弱，而而摇摇瓶瓶培培养养的的念念珠珠菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄年龄增长而增加增长而增加经常在幼酵母细胞中出现的经常在幼酵母细胞中出现的芽痕芽痕（Budscars）可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低2、细胞破碎技术的分类n细胞破碎的目的 是释放出细胞内含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。细胞破碎技术分类细胞破碎技术分类细胞细胞破碎破碎机械破碎机械破碎高高压压均均浆浆法法，珠珠磨磨法法、撞撞击击破破碎碎、超超声声波波破碎破碎非机械破碎非机械破碎物理法物理法渗渗透透压压冲冲击击、冻冻结结-融融化化、（超声波）（超声波）化学法化学法酸碱处理、化学试剂处理酸碱处理、化学试剂处理生物法生物法酶溶、自溶、噬菌体酶溶、自溶、噬菌体3、常用细胞破碎方法介绍（1）机械破碎高压匀浆）机械破碎高压匀浆细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速（可细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速（可达到达到450m/s）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。用下破碎。缺点：n这种方法较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。（2）机械破碎珠磨）机械破碎珠磨珠磨机的破碎室内填充有珠磨机的破碎室内填充有8085（v/v）的玻璃（密度为的玻璃（密度为2.5g/ml）或氧化锆（密度为或氧化锆（密度为6.0g/ml）的微球（粒径约的微球（粒径约0.11.0mm）。）。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球与微球在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球与微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。胞受到研磨剪切和撞击而破碎。缺点：n设备是珠后机，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。存在的问题：操作参数多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30左右。（3）机械破碎撞击破碎）机械破碎撞击破碎撞击破碎原理：撞击破碎原理：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千千/min），），形成粒径小于形成粒径小于50微米的微粒子，高速微米的微粒子，高速载气（如氮气，流速为载气（如氮气，流速为300m/s）将冻结的微粒子送将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。碎。（4）机械破碎超声波破碎）机械破碎超声波破碎 压电传感器将电子振荡器的交变电流转换压电传感器将电子振荡器的交变电流转换为声波。在超声波的作用下液体发生空化作用，为声波。在超声波的作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。剪切力，使细胞破碎。缺点：n超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。非机械破碎之非机械破碎之q酸碱处理酸碱处理q化学试剂处理化学试剂处理 q酶溶酶溶 q自溶自溶 q渗透压冲击法渗透压冲击法q冻结冻结-融化法融化法 （5）化学渗透法n有些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。缺点：n时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。（6）酶溶法n就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶，-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等。缺点：n易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。（7）破碎方式比较）破碎方式比较机械破碎机械破碎非机械破碎非机械破碎物理物理化学化学生物生物速度速度效率效率选择性选择性释放率释放率条件条件高高高高差差大大剧烈剧烈较低较低差差高高低低温和温和低低差差高高低低视方法定视方法定低低差差高高低低（7）细胞破碎技术研究发展方向n1、多种破碎方法相结合n2、与上游过程相结合n（1）克隆噬菌体溶解基因n（2）耐高温产品的基因表达n3、与下游过程相结合小结：n1、细胞分离n 重力沉淀、离心沉淀、过滤n2、细胞破碎n 机械破碎法与非机械破碎法，不同方法的区别n3、细胞破碎的发展方向。作业：n1、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。n2、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？