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第七章第七章 蛋白质的分离、纯化与表征蛋白质的分离、纯化与表征分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性附性及对配体的亲和性若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整整1、蛋白质的理化性质：、蛋白质的理化性质：酸碱性质、胶体性质与沉淀、颜色反应、酸碱性质、胶体性质与沉淀、颜色反应、变性变性2、分离纯化的方法：、分离纯化的方法：盐析、电泳、等电聚焦、层析等盐析、电泳、等电聚焦、层析等蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。度最小，在电场中不移动。在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白这种现象称为蛋白质电泳质电泳1 1、酸碱性质、酸碱性质阳离子PHPI兼性离子PH=PI可解离基团有末端和侧链可解离基团有末端和侧链故故pIpI与酸性、碱性氨基酸的数目有关与酸性、碱性氨基酸的数目有关如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定没有盐类没有盐类干扰时的干扰时的等电点叫等电点叫等离子点等离子点蛋蛋白白质质分分子子的的颗颗粒粒直直径径已已达达1-100nm1-100nm，处处于于胶胶体体颗颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。2 2、蛋白质的胶体性质：、蛋白质的胶体性质：蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：蛋白质溶液稳定的原因：1 1）表面形成水膜（水化层）表面形成水膜（水化层）2 2）带相同电荷。）带相同电荷。蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。出来。蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用1.1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。析出。2.2.分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH50%(NH4 4)2 2SOSO4 4饱和度），清蛋白（饱和饱和度），清蛋白（饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4)。2.2.加有机溶剂加有机溶剂3.3.加重金属盐加重金属盐4.4.加生物碱试剂加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。沉淀生物碱，称生物碱试剂。在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀不可逆沉淀一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。其生物活性，称为蛋白质的变性。二、变性的实质是二、变性的实质是破坏了蛋白质的空破坏了蛋白质的空间结构，并不引起间结构，并不引起一级结构的改变。一级结构的改变。3 3、蛋白质的变性、蛋白质的变性蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)。在在某某些些物物理理或或化化学学因因素素的的作作用用下下，蛋蛋白白质质严严格格的的空空间间结结构构被被破破坏坏（不不包包括括肽肽键键的的断断裂裂），从从而而引引起起蛋蛋白白质质若若干干理理化化性性质和生物学性质的改变质和生物学性质的改变蛋白质的变性蛋白质的变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。激烈的搅拌以及强酸和强碱等。变性蛋白质变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。团增加，易被酶消化。变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固凝固。有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。新变为天然蛋白质。引起蛋白质变性的因素有：引起蛋白质变性的因素有：物物理理因因素素：高高温温、高高压压、紫紫外外线线、电离辐射、超声波等；电离辐射、超声波等；化化学学因因素素：强强酸酸、强强碱碱、有有机机溶溶剂剂、重金属盐等。重金属盐等。变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变：物物理理性性质质：旋旋光光性性改改变变，溶溶解解度度下下降降，沉沉降降率率升升高高，粘粘度度升升高高，光光吸吸收收度度增加等；增加等；化化学学性性质质：官官能能团团反反应应性性增增加加，易易被蛋白酶水解。被蛋白酶水解。生生物物学学性性质质：原原有有生生物物学学活活性性丧丧失失，抗原性改变。抗原性改变。蛋白质变性的可逆性：蛋白质变性的可逆性：a)a)蛋蛋白白质质在在体体外外变变性性后后，绝绝大大多多数数情情况下是不能复性的；况下是不能复性的；b)b)如如变变性性程程度度浅浅，蛋蛋白白质质分分子子的的构构象象未未被被严严重重破破坏坏；或或者者蛋蛋白白质质具具有有特特殊殊的的分分子子结结构构，并并经经特特殊殊处处理理则则可可以复性。以复性。核核糖糖核核酸酸酶酶的的变变性性与与复复性性蛋蛋白白质质分分子子相相互互聚聚集集而而从从溶溶液液中中析析出出的现象称为的现象称为沉淀沉淀。变变性性后后的的蛋蛋白白质质由由于于疏疏水水基基团团的的暴暴露露而而易易于于沉沉淀淀，但但沉沉淀淀的的蛋蛋白白质质不不一一定定都是变性后的蛋白质。都是变性后的蛋白质。加加热热使使蛋蛋白白质质变变性性并并凝凝聚聚成成块块状状称称为为凝凝固固。因因此此，凡凡凝凝固固的的蛋蛋白白质质一一定定发发生变性。生变性。反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应AgNO3、Hg(NO3)2及 HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色Trp坂口反应(Sakaguchi反 应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基-氨基酸4 4、蛋白质的颜色反应、蛋白质的颜色反应OHN大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近附近显示强的吸收。显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。鉴定。5 5、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收蛋白质的分离与纯化方法蛋白质的分离与纯化方法（一）盐析与有机溶剂沉淀：（一）盐析与有机溶剂沉淀：1.1.盐析：盐析：在在蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入大大量量中中性性盐盐，以以破破坏坏蛋蛋白白质质的的胶胶体体性性质质，使使蛋蛋白白质从溶液中沉淀析出，称为质从溶液中沉淀析出，称为盐析盐析。常用的中性盐有：常用的中性盐有：硫酸铵硫酸铵、氯化钠、硫、氯化钠、硫酸钠等。酸钠等。盐析时，溶液的盐析时，溶液的pHpH在蛋白质的等电点处在蛋白质的等电点处效果最好。效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。质的变性。分段盐析：分段盐析：半半饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液可可沉沉淀淀血血浆浆球球蛋蛋白白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。2.2.有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：凡凡能能与与水水以以任任意意比比例例混混合合的的有有机机溶溶剂剂，如如乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮等等，均均可可用用于于沉沉淀淀蛋白质。蛋白质。沉沉淀淀原原理理是是：脱脱水水作作用用；使使水水的的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。介电常数降低，蛋白质溶解度降低。（二）电泳：（二）电泳：带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为电泳电泳（electrophoresis)electrophoresis)蛋蛋白白质质分分子子在在溶溶液液中中可可带带净净的的负负电电荷荷或或带带净净的的正正电电荷荷，故故可可在在电电场场中中发发生生移移动动。不不同同的的蛋蛋白白质质分分子子所所带带电电荷荷量量不不同同，且且分分子子大大小小也也不不同同，故故在在电电场场中中的的移移动动速速度度也也不不同同，据据此此可互相分离。可互相分离。电泳电泳蛋白质在等蛋白质在等电点电点pHpH条件条件下，不发生下，不发生电泳现象。电泳现象。利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。1.1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。行电泳。2.2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。状区域。（1 1）纸上电泳：用滤纸作支持物。）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。聚丙烯酰胺）作支持物。1 1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。+2 2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。进行的电泳。-+两种凝胶电泳两种凝胶电泳等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电+SDSPAGESDSPAGE中中SDSSDS的作用：的作用：阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷使得蛋白质的形状趋于一致使得蛋白质的形状趋于一致所以在这种特殊的电泳中，迁移所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，取决于蛋白质的大的形状无关，取决于蛋白质的大小（分子量）小（分子量）（三）层析：（三）层析：层层析析（chromatography)chromatography)是是一一种种利利用用混混合合物物中中各各组组分分理理化化性性质质的的差差异异，在在相相互互接接触触的的两两相相（固固定定相相与与流流动动相相）之之间间的的分分布布不不同同而进行分离分析的技术方法。而进行分离分析的技术方法。主主要要的的层层析析技技术术有有离离子子交交换换层层析析，凝凝胶胶层层析，吸附层析及亲和层析等。析，吸附层析及亲和层析等。凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质（四）超速离心：（四）超速离心：利利用用物物质质密密度度的的不不同同，经经超超速速离离心心后后，分布于不同的液层而分离。分布于不同的液层而分离。超超速速离离心心也也可可用用来来测测定定蛋蛋白白质质的的分分子子量量，蛋白质的分子量与其沉降系数蛋白质的分子量与其沉降系数S S成正比。成正比。蛋白质相对分子量在蛋白质相对分子量在10 000-1 000 00010 000-1 000 000之间。测之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法超离心法、凝、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是最准确可靠的方法是超离心法超离心法（SvedbergSvedberg于于19401940年设计）：蛋白质颗粒在年设计）：蛋白质颗粒在25-50*1025-50*104 4 g g离心力作用离心力作用下从溶液中沉降下来。下从溶液中沉降下来。沉降系数（沉降系数（s s）：单位（）：单位（cmcm）离心场里的沉降速度。）离心场里的沉降速度。s=v2x v v=沉降速度（沉降速度（dx/dtdx/dt）=离心机转子角速度（弧度离心机转子角速度（弧度/s/s）x x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（蛋白质界面中点与转子中心的距离（cmcm）沉降系数的单位常用沉降系数的单位常用S S，1S=1101S=110-13-13（s s）蛋白质分子量（蛋白质分子量（M M）与沉降系数（）与沉降系数（s s）的关系）的关系M=RTsD（1V）R气体常数（气体常数（8.314107ergsmol-1 度度-1）T绝对温度绝对温度D扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（溶剂密度（20，gml-1）s沉降系数沉降系数