生物制药工艺学第9章亲和纯化技术.ppt

第九章第九章 亲和纯化技术亲和纯化技术v利用生物分子间的利用生物分子间的特异性结合作用特异性结合作用的原理进的原理进行生物物质分离纯化的技术称为行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术亲和纯化技术（Affinity purificationAffinity purification）1技术要点技术要点v（1）找与底物）找与底物专一专一可逆结合可逆结合的配基；的配基；v（2）将配基通过）将配基通过共共价键价键偶联到基质；偶联到基质；v（3）配基）配基与与底物底物吸吸附附；v（4）洗脱目标物。）洗脱目标物。2亲和纯化技术亲和纯化技术v亲和层析亲和层析(Affinity chromatography)(Affinity chromatography)v亲和过滤（膜分离）亲和过滤（膜分离）v亲和分配（双水相萃取）亲和分配（双水相萃取）v亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）v亲和沉淀（沉淀）亲和沉淀（沉淀）v亲和电泳（电泳）亲和电泳（电泳）3第一节第一节 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)v利利用用生生物物大大分分子子物物质质具具有有与与某某些些相相应应的的分分子子专专一一性性可可逆逆结结合合的的特特性性而而建建立立的层析技术。的层析技术。v适适用用于于从从成成份份复复杂杂且且杂杂质质含含量量远远大大于于目标物的混合物中提纯目标物。目标物的混合物中提纯目标物。4特点特点v经过一次处理可得到经过一次处理可得到高纯度活性高纯度活性物质物质；v特异性强特异性强、分离效果好、分离条件温和、分离效果好、分离条件温和；v亲和吸附剂通用性较差，亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂专用的吸附剂。5亲和吸附剂：载体亲和吸附剂：载体配基配基v在亲和层析中起在亲和层析中起可逆结合的特异可逆结合的特异性物质称为性物质称为配基配基（Ligand）。）。v与配基结合的层与配基结合的层析介质称为析介质称为载体载体（Matrix）。）。6一、亲和层析的原理一、亲和层析的原理v（1）配配基基固固定定化化：配配基基与与载载体体偶偶联联，结结合合成成具具有有特特异亲和性的分离介质。异亲和性的分离介质。v（2）吸吸附附样样品品：亲亲和和层层析析介介质质选选择择性性吸吸附附生生物物活活性性物质物质.（3）样样品品解解吸吸：选选择择适适宜宜的的条条件件使使被被吸吸附附物物活活性性物物质解吸。质解吸。动画动画7二、亲和层析载体二、亲和层析载体（一）、亲和层析对载体的要求：（一）、亲和层析对载体的要求：v（1）充分）充分功能化功能化，与配基进行共价连接。，与配基进行共价连接。v（2）有较好的）有较好的理化稳定性和生物惰性理化稳定性和生物惰性。v（3）具有高度的）具有高度的水不溶性和亲水性水不溶性和亲水性。v（4）具有）具有多孔的立体网状结构多孔的立体网状结构。v（5）应为）应为大小均匀大小均匀的刚性小球。的刚性小球。8（二）、常用载体（二）、常用载体 v纤维素纤维素(cellulose)v琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 v葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 v聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 v多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass）v其它载体其它载体壳聚糖壳聚糖(Chitosan)91 1、纤维素、纤维素v纤维素纤维素结构紧密结构紧密、均一性差，不利于大、均一性差，不利于大分子的渗入。分子的渗入。v非特异性吸附力较强，非特异性吸附力较强，空间位阻空间位阻。v主要用于主要用于分离与核酸有关的物质分离与核酸有关的物质。102 2、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶v琼脂糖浓度有琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为，商品为Sepharose 2B、4B和和6B（Pharmacia）。）。v保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松功能基团，结构疏松孔径大，流速快孔径大，流速快。vSepharose CL,稳定性明显增加，能在稳定性明显增加，能在pH314中应用。中应用。11 v 3 3、葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶：v葡聚糖凝胶孔径太小葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。应用受到限制。v4 4、聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：Bio-gel Pv 有有供供化化学学反反应应的的酰酰胺胺基基，能能制制得得配配基基含含量量较较高的亲和柱高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。，适用于亲和势比较低的系统。v pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。过高或过低的溶液中酰胺基易水解。12 v5 5、多孔玻璃珠：多孔玻璃珠：v化学与物理稳定性化学与物理稳定性较好，机械强度高。较好，机械强度高。v缺缺点点：亲亲水水性性不不强强，对对蛋蛋白白质质尤尤其其是是碱碱性性蛋蛋白白质质有有非特异性吸附非特异性吸附，化学活性基团少。，化学活性基团少。v6 6、其它载体、其它载体壳聚糖壳聚糖13壳聚糖壳聚糖(甲壳素和壳聚糖甲壳素和壳聚糖)14三三、亲和配基亲和配基 v配基的选择配基的选择v配基的配基的浓度浓度v配基偶联的配基偶联的位置位置v配基分子的配基分子的大小大小v配基的配基的类型类型15（一）、配基的选择（一）、配基的选择 v亲和层析配基的选用主要取决于分离对亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。象。v v1 1、配基与配体有足够大的亲和力、配基与配体有足够大的亲和力（亲（亲和势），和势），K KL L 在在10-410-8之间之间。v2 2、配基与配体的结合应是专一的、配基与配体的结合应是专一的。v3 3、配基应具有化学活性、配基应具有化学活性。16亲和势亲和势KL（EL复合物的解离常数复合物的解离常数）v 分配比分配比:结合酶结合酶/游离游离酶酶阻留值阻留值:Ve/V017（二）、配基的浓度（二）、配基的浓度 v对对亲亲和和势势比比较较低低的的系系统统（KL10-4mol/L），增加增加配基浓度配基浓度有利于吸附。有利于吸附。v增加增加亲和柱的长度亲和柱的长度来提高吸附率。来提高吸附率。v配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。v理想的配基浓度为理想的配基浓度为1-10mol/L。18（三）、配基偶联的位置（三）、配基偶联的位置v配配基基固固定定化化时时，其其不不参参与与亲亲和和结合的部位与载体进行偶联结合的部位与载体进行偶联。vAMP-Sepharose亲和柱亲和柱v腺腺嘌嘌呤呤N6-氨氨基基接接到到载载体体上上，对对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。脱氢酶和甘油激酶有吸附力。v磷磷酸酸基基接接到到载载体体上上，对对甘甘油油醛醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。磷酸脱氢酶有吸附力。19第一节第一节 亲和层析亲和层析v一、亲和层析的原理一、亲和层析的原理v二、亲和层析载体二、亲和层析载体v三三、亲和配基亲和配基v 配基的选择配基的选择v 配基的浓度配基的浓度v 配基偶联的位置配基偶联的位置v 配基分子的大小配基分子的大小v 配基的类型配基的类型20（四）、配基分子的大小（四）、配基分子的大小 v选用选用大分子配基大分子配基。v小分子物质作为配基，小分子物质作为配基，载体和配基间插入一载体和配基间插入一个个“手臂手臂”以消除空以消除空间障碍。间障碍。21（五）、配基的类型（五）、配基的类型 v较小的有机分子或天然生物活性物质较小的有机分子或天然生物活性物质。v根据配基应用和性质根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基特殊配基和通用配基。v特殊配基特殊配基（special ligandspecial ligand）22通用配基（通用配基（general ligand）v用于一类物质的分离提纯。用于一类物质的分离提纯。v用用NADH作作脱氢酶脱氢酶类亲和层析的通用配基；类亲和层析的通用配基；v用用ATP作激酶类亲和层析的通用配基；作激酶类亲和层析的通用配基；v用用外外源源性性凝凝集集素素作作糖糖蛋蛋白白类类亲亲和和层层析析时时的的通通用配基等。用配基等。v 23四、四、载体的活化与偶联载体的活化与偶联 v糖类载体的活化与偶联糖类载体的活化与偶联 v聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联活化与偶联v用于固定化配基的凝胶衍生物用于固定化配基的凝胶衍生物 24（一）、糖类载体活化与偶联（一）、糖类载体活化与偶联 v溴化氰溴化氰活化法活化法v高碘酸氧化法高碘酸氧化法v环氧化法环氧化法v甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法v双功能试剂法双功能试剂法25溴化氰活化法溴化氰活化法 v载载体体如如琼琼脂脂糖糖、葡葡聚聚糖糖等等，在在碱碱性性条条件件下下用用溴溴化化氰氰处处理理，可可引引入入活活泼泼的的“亚亚氨氨基基碳碳酸酸”中中间间体。体。v在在弱弱碱碱的的条条件件下下直直接接与与含含有有游游离离脂脂肪肪族族氨氨基基或或芳香族氨基的配基芳香族氨基的配基偶联。偶联。26方法27高碘酸氧化法高碘酸氧化法 v多糖载体与的多糖载体与的高碘酸钠高碘酸钠氧化反应氧化反应24小时会产生醛；小时会产生醛；v在在温温和和条条件件下下，醛醛与与赖赖氨氨酸酸上上的的-NH2生生成成西西夫夫碱碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺烷基胺。28 环氧化法环氧化法v碱碱性性条条件件下下，多多糖糖载载体体与与环环氧氧氯氯丙丙烷烷作作用用生生成成环氧化合物；环氧化合物；v环氧化合物又与环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联氨基酸或蛋白质上氨基偶联。29 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法v甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法v在无水丙酮中进行。在无水丙酮中进行。v优点：优点：活化反应迅速；活化反应迅速；v 偶联条件温和；偶联条件温和；v 偶联效率高。偶联效率高。30双功能试剂法双功能试剂法v双双功功能能试试剂剂是是同同一一分分子子中中具具有有两两个个反反应应活活性性基基团团的的化学试剂，常作为连接两个分子的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁桥梁”。v二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐v优优点点：反反应应速速度度快快、条条件件温温和和，能能与与氨氨基基、糖糖类类、酚、醇类等偶联。酚、醇类等偶联。v 31（二）、二）、聚丙烯酰胺凝胶及聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联其它凝胶衍生物活化与偶联v叠氮化法叠氮化法 v重氮化法重氮化法(含氨基载体含氨基载体)v碳二亚胺缩合法（含羧基载体）碳二亚胺缩合法（含羧基载体）32聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法v有大量可修饰的有大量可修饰的酰胺基酰胺基。v酰胺基能被酰胺基能被含氮化合物含氮化合物置换制备多种衍生物。置换制备多种衍生物。33叠氮化法叠氮化法v聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺的的酰酰肼肼衍衍生生物物，加加1mol/L的的亚亚硝硝酸酸，反应液搅反应液搅90s；v加入加入脂肪胺类配基脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。，制得亲和吸附剂。34重氮化法重氮化法v-氨氨基基烷烷基基琼琼脂脂糖糖衍衍生生物物，对对硝硝基基苯苯甲甲酰酰氯氯反反应应，制制得得对对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。v用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物重氮盐衍生物。v配基与重氮盐衍生物偶联配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。，制得亲和层析柱。35碳二亚胺缩合法碳二亚胺缩合法v碳碳二二亚亚胺胺为为羧基活化剂羧基活化剂。v反反应应中中的的脲脲衍衍生生物物可可用用有有机机溶溶剂剂洗洗涤除去。涤除去。36（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物 1、CNBr活化的活化的Sepharose 4BvSepharose 4B经经CNBr活活化化，可可偶偶联联蛋蛋白白和和核核酸类配基。酸类配基。2、AH-Sepharose 4B和和CH-Sepharose 4B含有含有6个碳原子的个碳原子的”手臂手臂”的琼脂糖衍生物的琼脂糖衍生物 vAH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基用于含有羧基的一类配基。vCH-Sepharose 4B能能与与含含有有一一级级氨氨基基的的配配基基偶偶联。联。37v 383、环氧活化型、环氧活化型Sepharose 6Bv由亲水由亲水“手臂手臂”与与Sepharose 6B载体通载体通过醚链形成的衍生物。过醚链形成的衍生物。v用于用于小分子配基的固定化小分子配基的固定化。v用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。394、活化型亲和胶、活化型亲和胶10和和15v由由N-羟琥珀酰亚胺羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。与琼脂糖衍生物形成的活化酯。vAffi-Gel10的的“手手臂臂”长长为为10个个碳碳原原子子，产产生生一一些些负负电电荷，荷，有利于碱性或中性蛋白偶联有利于碱性或中性蛋白偶联；vAffi-Gel15为为15个个碳碳原原子子的的“手手臂臂”，产产生生一一些些正正电电荷荷，故故有利于酸性蛋白的偶联有利于酸性蛋白的偶联。405 5、CM-CM-生物胶生物胶生物胶生物胶A A、亲和胶、亲和胶、亲和胶、亲和胶202202和亲和胶和亲和胶和亲和胶和亲和胶102102vCM Bio-Gel A，无无“手臂手臂”的的羧基衍生物羧基衍生物；vAffi-Gel 102具有具有6个原子个原子“手臂手臂”，未端为氨基。，未端为氨基。vAffi-Gel202具有具有10个原子的个原子的“手臂手臂”，未端具有羧基；，未端具有羧基；41五、五、影响吸附亲和力的几个因素影响吸附亲和力的几个因素 vK KL Lv配基浓度配基浓度对亲和力的影响对亲和力的影响v空间障碍空间障碍的影响的影响v配基与载体的配基与载体的结合位点结合位点的影响的影响v载体孔径载体孔径的影响的影响v微环境微环境的影响的影响42（一）、配基浓度对亲和力的影响（一）、配基浓度对亲和力的影响v为为将将亲亲和和配配体体与与其其它它物物质质分分开开，需需要要阻阻留留值值10。v配基浓度配基浓度与与亲和对解离常数亲和对解离常数相关。相关。v对于低亲和力系统，对于低亲和力系统，配基浓度配基浓度。43（二）、空间障碍的影响（二）、空间障碍的影响v空间位阻。空间位阻。v对对于于分分子子大大的的配配体体以以及及小小分子配基分子配基更明显。更明显。v“手手臂臂”，增增加加与与载载体体相相连连配配基基的的活活动动度度，减减轻轻载载体的立体障碍。体的立体障碍。v常用的常用的“手臂手臂”多为烃链多为烃链。44（三）、配基与载体的结合位点的影响（三）、配基与载体的结合位点的影响v多肽或蛋白质等大分子配基多肽或蛋白质等大分子配基v须须控控制制偶偶联联反反应应条条件件，使使它它以以最最少少的的功功能能基基团团与载体连接与载体连接。v保保持持蛋蛋白白质质原原有有的的高高级级结结构构，使使亲亲和和吸吸附附剂剂具具有较大的亲和力。有较大的亲和力。45v（四）、载体孔径的影响（四）、载体孔径的影响v载体孔隙是配体向配基接近的通道。载体孔隙是配体向配基接近的通道。v孔径大小孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。对吸附剂亲和能力有影响。v（五）、微环境的影响（五）、微环境的影响v载体及载体及“手臂手臂”的的电性、极性电性、极性对亲和力的影响。对亲和力的影响。v避免引入离子键的基团避免引入离子键的基团。v疏水作用疏水作用的存在，会引起的存在，会引起非特异性吸附非特异性吸附作用。作用。46六、六、配基与间隔臂的连接配基与间隔臂的连接 v（一）、含氮配基的连接（一）、含氮配基的连接v（二）、含羧基配基的连接（二）、含羧基配基的连接v（三）、含巯基配基的连接（三）、含巯基配基的连接v（四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接（四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接47七、七、亲和层析的吸附和洗脱亲和层析的吸附和洗脱 v影响影响吸附吸附的条件的条件v亲和层析的亲和层析的洗脱洗脱v亲和吸附剂的再生亲和吸附剂的再生48（一）、影响吸附的条件（一）、影响吸附的条件 v亲和吸附剂及配体的性质亲和吸附剂及配体的性质v缓缓冲冲液液的的种种类类、离离子子强强度度、pH、温温度度和层析流速有关。和层析流速有关。v温度温度升高会使吸附作用减弱。升高会使吸附作用减弱。v流速流速每小时低于每小时低于10 ml/cm2。v上样体积上样体积为柱床体积的为柱床体积的5%。49非专一性吸附非专一性吸附 v亲和层析中的非专一性吸附。亲和层析中的非专一性吸附。v 离子效应离子效应v 疏水基团疏水基团v 复合亲和力复合亲和力50离子效应离子效应 v配配基基与与载载体体-间间隔隔臂臂的的不不完完全全结结合合，将将无无关关离离子子基基团团引入引入吸附剂。吸附剂。v具具有有离离子子基基团团的的亲亲和和吸吸附附剂剂会会影影响响蛋蛋白白质质的的洗洗脱脱行行为。为。51疏水基团疏水基团v吸吸附附剂剂疏疏水水性性基基团团与与蛋蛋白白质质结结构构中中的的疏水区相互吸引，形成疏水区相互吸引，形成非专一性非专一性吸附。吸附。v疏水基团：疏水基团：v（1）长的烃链结构的）长的烃链结构的“手臂手臂”：v（2）疏水性配基：）疏水性配基：52复合亲和力复合亲和力v离子效应离子效应作用，又有作用，又有疏水作用疏水作用。v配体与配基有较强生物特异性。配体与配基有较强生物特异性。v用用高高浓浓度度的的盐盐和和有有机机溶溶剂剂，以以提提高高选选择性。择性。53（二）、亲和层析的洗脱（二）、亲和层析的洗脱v洗脱：洗脱：v洗脱方法主要有三种：洗脱方法主要有三种：v 非专一性洗脱非专一性洗脱v 特殊洗脱特殊洗脱v 专一性洗脱专一性洗脱54非专一性洗脱非专一性洗脱v 改变改变洗脱剂的洗脱剂的pH。v 离子强度的离子强度的分步和梯度变化分步和梯度变化.v亲亲和和势势很很高高，促促溶溶离离子子，其其洗洗脱脱能能力力的的强强弱弱顺顺序序ClICF3COOSCN CCl3COO。v用蛋白质变性剂（如脲或用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍盐酸胍）。）。55特殊洗脱特殊洗脱v裂解配基与载体的连接键裂解配基与载体的连接键。v断裂方法有：断裂方法有：v硫酯键硫酯键用羟胺处理用羟胺处理30分钟；分钟；v偶氮键偶氮键用用连二亚硫酸钠连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理；硼酸缓冲液处理；v二二硫硫键键用用巯巯基基乙乙醇醇、半半胱胱氨氨酸酸、二二硫硫苏苏糖醇糖醇等处理。等处理。56专一性洗脱专一性洗脱vS（固定化配基），固定化配基），E（酶），酶），I（游离配基）游离配基）v（1）竞竞争争性性效效应应，即即ESI不不如如EI稳稳定定，增增加加洗洗脱剂中脱剂中I，会使，会使E洗脱下来洗脱下来（正洗脱）。（正洗脱）。v（2）当当ESI稳稳定定性性与与EI相相同同时时，I的的存存在在并并不不影响影响E对对S的结合，非竞争性效应。的结合，非竞争性效应。v（3 3）反竞争性效应）反竞争性效应，即，即ESI比比EI稳定，稳定，I使使E与与S结合更紧密结合更紧密（负洗脱）（负洗脱）。57反竞争性效应反竞争性效应58亲和层析中常用作分离酶的配基有：亲和层析中常用作分离酶的配基有：v 酶抑制剂酶抑制剂v 辅酶辅酶v 底物底物v 底物结构类似物底物结构类似物 59配基的选择和洗脱条件配基的选择和洗脱条件 60（三）、亲和吸附剂的再生（三）、亲和吸附剂的再生v用缓冲液充分用缓冲液充分平衡平衡后即可重复使用。后即可重复使用。v亲亲和和力力下下降降，非非特特异异吸吸附附增增加加，大大多多由由变性蛋白变性蛋白沉积造成，用沉积造成，用6mol/L脲脲洗柱。洗柱。61八、其他亲和层析八、其他亲和层析 v金属金属离子离子亲和层析亲和层析v有机染料亲和层析有机染料亲和层析v拟生物亲和层析拟生物亲和层析（Biomimetic Biomimetic AFCAFC）62（一）、金属螯合亲和层析一）、金属螯合亲和层析v将将环环氧氧活活化化型型Sepharose 6B与与金金属属螯螯合合剂剂偶偶联联，再再用用金金属属离离子子溶溶液液处处理理制制成成金金属属螯螯合合亲和层析柱。亲和层析柱。v金金属属螯螯合合剂剂:亚亚氨氨二二醋醋酸酸、氨氨基基水水杨杨酸酸、8-羟羟基喹啉、羧甲基氨基酸等基喹啉、羧甲基氨基酸等.63v蛋蛋白白质质上上的的氨氨基基酸酸残残基基，如如组组氨氨酸酸的的咪咪唑唑基基、半半胱胱氨氨酸酸的的巯巯基基和和色色氨氨酸酸的的吲吲哚哚基基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。，利于蛋白质与固定化金属离子结合。v金属离子如金属离子如锌和铜锌和铜。64v吸附：吸附：pH在在68。v洗洗脱脱：降降低低pH值值、增增加加离离子子强强度度、或或在在缓缓冲冲液液中加中加5mmol/L EDTA等方法。等方法。特点：特点：v 蛋白质蛋白质吸附容量吸附容量大；大；v 价格便宜；价格便宜；v 具有普遍适用性。具有普遍适用性。65（二）、有机染料亲和层析（二）、有机染料亲和层析v需需NAD+为为辅辅酶酶的的酶酶，对对染料具有一定亲和力。染料具有一定亲和力。v染染料料共共价价偶偶联联到到琼琼脂脂糖糖载载体上，能制得亲和层析柱。体上，能制得亲和层析柱。v染染料料亲亲和和层层析析已已成成功功的的分分离纯化了多种酶。离纯化了多种酶。66亲和层析亲和层析v一一、原理、原理v二二、亲和层析载体亲和层析载体v三三、亲和配基亲和配基 v四四、载体的活化与偶联载体的活化与偶联v五五、影响吸附亲和力的因素影响吸附亲和力的因素v六六、配基与间隔臂的连接配基与间隔臂的连接v七七、亲和层析的吸附和洗脱亲和层析的吸附和洗脱v八、其他亲和层析八、其他亲和层析67第二节第二节 其他亲和纯化技术其他亲和纯化技术v一、亲和过滤（膜分离）一、亲和过滤（膜分离）v二、亲和分配（双水相萃取）二、亲和分配（双水相萃取）v三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取）三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取）v四、亲和沉淀（沉淀分级）四、亲和沉淀（沉淀分级）v五、亲和电泳（电泳）五、亲和电泳（电泳）68一、一、亲和过滤亲和过滤（Affinity FiltrationAffinity Filtration）v将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲亲和错流过滤和错流过滤和和亲和膜分离亲和膜分离。v亲和错流过滤亲和错流过滤（affinity Cross Flow affinity Cross Flow Filtration,ACFFFiltration,ACFF）:亲和层析与超滤技术亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。的优点。69亲和错流过滤亲和错流过滤 （affinity Cross Flow affinity Cross Flow FiltrationFiltration）v基质基质及及大分子亲和配基大分子亲和配基v基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行面。配基对提取的目标物进行专一可逆专一可逆的吸附，形的吸附，形成成复合体复合体；v用膜对混合液进行错流过滤，用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可复合体因分子巨大可被保留被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。离。70基质基质 v聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 v菌类的完整细胞菌类的完整细胞（酵母酵母、芽胞杆菌、芽胞杆菌、链球菌等细胞）链球菌等细胞）v琼脂糖、脂质体等琼脂糖、脂质体等 酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A71亲和膜亲和膜（affinity membrane）v亲和膜利用亲和膜利用亲和配基亲和配基修饰的修饰的微滤膜微滤膜为亲和吸附介质为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析固定床亲和层析的变型。的变型。v将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。72亲和膜优点亲和膜优点 v传质阻力小传质阻力小，达到吸附平衡的时间短；，达到吸附平衡的时间短；v配基利用率高，配基利用率高，配基用量低配基用量低；v压降小，流速快；压降小，流速快；v设备体积小。设备体积小。73二、亲和萃取二、亲和萃取 （Affinity extraction）v定定义义：利利用用偶偶联联亲亲和和配配基基的的PEG为为成成相相聚聚合合物物进进行行的的双双水水相相萃萃取取，在在亲亲和和配配基基的的亲亲和和结结合合作作用用下下促促进进目目标标产产物物在在PEG相相（上上相相）的的分分配配，提提高高目目标标产产物物的的分分配配系系数数和和选择性选择性。v PEG/Dextran,PEG/无机盐无机盐74vmA目标分子的亲和分配系数目标分子的亲和分配系数 vT和和B分别表示上相和下相；分别表示上相和下相；vmA和和m O为有、无配基时目标分子的分配系数；为有、无配基时目标分子的分配系数；vm L为配基的分配系数；为配基的分配系数；vCL为配基浓度；为配基浓度；vKd为配基与目标分子反应的解离常数。为配基与目标分子反应的解离常数。v上相配基浓度上相配基浓度CLT越高，越高，m A越大越大 75亲和萃取纯化过程亲和萃取纯化过程 v亲和分配（进料），亲和分配（进料），v杂蛋白反萃取（清杂蛋白反萃取（清洗）洗）v目标产物反萃取目标产物反萃取（洗脱）（洗脱）。76三、亲和反胶团萃取三、亲和反胶团萃取（Affinity-based reversed micellar extraction）v定定义义：指指在在反反胶胶团团相相中中除除通通常常的的表表面面活活性性剂剂以以外外，添添加加另另一一种种亲亲水水头头部部为为亲亲和和配配基基的的助助表表面面活活性性剂剂（cosurfactant）；）；v通通过过亲亲和和配配基基与与目目标标分分子子的的亲亲和和结结合合作作用用，促促进进目目标标产产物在反胶团相的分配。物在反胶团相的分配。77亲和反胶团萃取过程亲和反胶团萃取过程78反萃取反萃取79四、亲和沉淀四、亲和沉淀（Affinity precipitation）v亲和沉淀亲和沉淀:是是生物亲和相互作用生物亲和相互作用与与沉淀分离沉淀分离相相结合的生物大分子的分离纯化技术。结合的生物大分子的分离纯化技术。v v一次作用亲和沉淀一次作用亲和沉淀v二次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀80一次作用亲和沉淀一次作用亲和沉淀v水水溶溶性性化化合合物物分分子子上上偶偶联联有有两两个个或或两两个个以以上上的的亲亲和配基和配基v双配基（双配基（bis-ligand）；多配基（）；多配基（polyligand）。）。v双双配配基基或或多多配配基基与与含含有有两两个个以以上上亲亲和和结结合合部部位位的的多多价价蛋蛋白白质质产产生生亲亲和和交交联联，增增大大为为较较大大的的交交联联网网络而沉淀。络而沉淀。81二次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀 v制备亲和沉淀介质制备亲和沉淀介质:利用在利用在物理场物理场改变时溶解改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物水溶性聚合物为为载体载体固定亲和配基。固定亲和配基。v亲和介质结合目标分子后，通过亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场改变物理场使使介质与目标分子共同沉淀介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次的方法称为二次作用亲和沉淀。作用亲和沉淀。v离心或过滤回收沉淀。离心或过滤回收沉淀。v沉淀清洗后加入洗脱剂纯化目标产物。沉淀清洗后加入洗脱剂纯化目标产物。82可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺83可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物聚合脂质体（聚合脂质体（polymerized liposome,PLS）v 84亲和沉淀纯化技术优点亲和沉淀纯化技术优点 v（1）溶溶液液中中进进行行，无无扩扩散散传传质质阻阻力力，亲亲和和结结合合速速度快；度快；v（2）亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；）亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；v（3）离心或过滤技术回收沉淀，规模放大；）离心或过滤技术回收沉淀，规模放大；v（4）可用于）可用于高粘度高粘度或或含微粒含微粒料液中目标产物纯化。料液中目标产物纯化。85五、亲和电泳（五、亲和电泳（Affinity Affinity ElectrophoresisElectrophoresis）v亲和电泳是将亲和层析与电泳技术结合起来，亲和电泳是将亲和层析与电泳技术结合起来，将亲和层析的将亲和层析的吸附剂包埋到琼脂凝胶板吸附剂包埋到琼脂凝胶板上制成上制成AEP载体。载体。v（1）、）、外源凝集素亲和电泳外源凝集素亲和电泳（Lectin Affinity Electrophoresis，LAE）v（2）、）、毛细管亲和电泳毛细管亲和电泳（Capillary Affinity Electrophoresis，CAE）86外源凝集素亲和电泳外源凝集素亲和电泳v利用利用外源凝集素外源凝集素对目标蛋白质的特对目标蛋白质的特异性作用进行亲和电泳。异性作用进行亲和电泳。v 适用于分析血清糖蛋白。适用于分析血清糖蛋白。87毛细管亲和电泳毛细管亲和电泳v 将亲和技术应用于毛细管电泳将亲和技术应用于毛细管电泳毛细管亲和毛细管亲和电泳电泳。v v原理：根据底物、配基、与底物原理：根据底物、配基、与底物-配基复合物的配基复合物的迁移时间不同，采用毛细管区带电泳测定迁移时间不同，采用毛细管区带电泳测定Kd或或Kb。v用于手性药物及用于手性药物及DNA片段的特异性分离。片段的特异性分离。8889思考题v1 1、亲和层析洗脱方法有、亲和层析洗脱方法有 ，。v2 2、亲和力大小除由亲和对本身的、亲和力大小除由亲和对本身的 决定外，还受许多因素的影决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂响，其中包括亲和吸附剂 、v 、等。等。v3、亲和层析中常用作分离酶的配基有、亲和层析中常用作分离酶的配基有 ，和和 。v4、亲和层析中非专一性吸附有、亲和层析中非专一性吸附有 、。v5、亲亲和和过过滤滤指指的的是是将将 和和 结结合合运运用用，它它包包括括 和和 两两大方法。大方法。v6、制备亲和柱时，应首先选用的配基是、制备亲和柱时，应首先选用的配基是 （）vA.大分子的大分子的 B.小分子的小分子的 C.中等大小的中等大小的 D.不确定不确定v7 7、亲亲 和和 层层 析析 的的 洗洗 脱脱 过过 程程 中中，在在 流流 动动 相相 中中 加加 入入 配配 基基 的的 洗洗 脱脱 方方 法法 称称 作作 （）v A.A.阴性洗脱阴性洗脱 B.B.剧烈洗脱剧烈洗脱 C.C.竞争洗脱竞争洗脱 D.D.非竞争洗脱非竞争洗脱 90