细胞培养技术-每代细胞.ppt
每代细胞每代细胞每代细胞每代细胞滞留期滞留期 lag phase概述概述 传代传代:恢复期恢复期 适应期适应期 原代培养原代培养:开始开始时细胞时细胞 必须经历的时期必须经历的时期2 2种情况种情况 分散细胞接种分散细胞接种:游离游离-吸附吸附-潜伏期潜伏期 组织块组织块:潜伏期潜伏期 滞留期滞留期原因原因:操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物 黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤 接种接种细胞细胞:适应，恢复，积累适应，恢复，积累(代谢中间产物代谢中间产物)组织块组织块:细胞迁移出细胞迁移出一般经数小时一般经数小时-几天几天滞留期滞留期过程过程:游离游离:悬浮悬浮,胞质回缩胞质回缩,全部细胞全部细胞变为变为圆球形圆球形 吸附吸附:贴附底物贴附底物,一般一般2424小时内小时内 贴壁贴壁 潜伏期潜伏期:可有可有运动活动运动活动,基本基本无增殖无增殖,少见分裂相少见分裂相 滞留期滞留期影响因素影响因素滞留期的长短与细胞种类、按种的细胞密度、培滞留期的长短与细胞种类、按种的细胞密度、培养条件等因素有关。养条件等因素有关。1.1.细胞密度细胞密度 接种分散细胞接种分散细胞,接种的接种的密度越大密度越大、数量越多，、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长 滞留期滞留期-影响因素影响因素2.细胞类型细胞类型传代传代培养培养的细胞之滞留期的细胞之滞留期 比原代培养的比原代培养的细胞短细胞短。单个细胞快单个细胞快,细胞大团慢细胞大团慢,组织块慢组织块慢连续细胞系连续细胞系与发生恶性与发生恶性转化的细胞转化的细胞 比有限细胞系与正常二倍体细胞的比有限细胞系与正常二倍体细胞的短短来源来源 胚胎胚胎组织组织:短短,成体成体:长长 滞留期滞留期-影响因素影响因素3.细胞机能状态细胞机能状态 不良者慢不良者慢4.培养条件培养条件 培养液培养液,pH,底物底物 不利不利:污染污染,有毒有毒 指数生长期指数生长期 exponential(log)phase概述概述 潜伏期结束后潜伏期结束后 即开始指数生长期，即开始指数生长期，或称或称对数生长期对数生长期。细胞生长所需细胞生长所需 各种营养条件具备后各种营养条件具备后进入进入特点特点 是细胞是细胞增生最活跃增生最活跃、活力最旺盛活力最旺盛的阶段的阶段 培养物中培养物中细胞数量呈指数增长细胞数量呈指数增长,细胞群体均一细胞群体均一 实验理想实验理想 判断判断细胞生长细胞生长的的指标指标判断细胞生长的指标判断细胞生长的指标指数生长期内指数生长期内细胞分裂活动的程度细胞分裂活动的程度(增殖活性增殖活性)可作为可作为判断细胞生长判断细胞生长是否旺盛的重要是否旺盛的重要指标指标1.1.有丝分裂指数有丝分裂指数(MI):培养物中培养物中分裂相数量占分裂相数量占 全部细胞数量的百分比全部细胞数量的百分比 统计时，每瓶至少需计数统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。个细胞。一般一般细胞的细胞的MI约为约为0.10.5%原代培养原代培养物的物的MIMI比继代培养物比继代培养物低。低。连续细胞系连续细胞系和和肿瘤细胞高肿瘤细胞高，可达可达3%5%。2.2.细胞群体倍增时间细胞群体倍增时间:培养物中培养物中细胞数量翻倍的平均时间细胞数量翻倍的平均时间间接反映细胞活力和增殖活动强弱，有间接反映细胞活力和增殖活动强弱，有3.3.MTT法法：反映细胞内一种酶活性程度反映细胞内一种酶活性程度4.4.标记核苷酸标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：掺入量：反映反映DNA合成细胞的增殖活性细胞的增殖活性与细胞种类、供体年龄以及培养与细胞种类、供体年龄以及培养条件等条件等多种因素密切相关多种因素密切相关。细胞生长一定阶段细胞生长一定阶段(指数生长期一般持续指数生长期一般持续35 d35 d）,即可即可长满培养器皿长满培养器皿，相互汇合成片相互汇合成片 (铺满铺满 confluence汇合汇合)铺满：细胞彼此连接成层长满器皿底壁。铺满：细胞彼此连接成层长满器皿底壁。(细胞相互之间紧密接细胞相互之间紧密接 触，所有可供生长的区域己被利用触，所有可供生长的区域己被利用)。正常细胞正常细胞(非转化细胞非转化细胞)，当，当细胞相互接触细胞相互接触 连接成片连接成片，出现，出现接触抑制接触抑制 接触抑制以后接触抑制以后，虽然运动受抑制，虽然运动受抑制，但只要但只要营养成分充足营养成分充足，仍可，仍可短期短期的的分裂增殖分裂增殖 只有当只有当细胞细胞密度增大密度增大到一定程度，到一定程度，细胞便细胞便不再分裂增殖不再分裂增殖。为为密度依赖性密度依赖性细胞细胞生长抑制生长抑制当当细胞细胞分裂停止分裂停止后，细胞数量即不再增加后，细胞数量即不再增加 进入平台期进入平台期 平台期平台期 Plateau(stationary)phase概述概述 细胞细胞铺满后铺满后再再1-2倍增倍增,进入进入 细胞达细胞达饱和密度饱和密度,可可存活存活 仍有代谢活动，但仍有代谢活动，但基本不分裂基本不分裂 细胞数量维持在某一水平上，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞生长活动停滞.饱和密度饱和密度：在培养细胞的平台期，可供细胞：在培养细胞的平台期，可供细胞 生长的底物面枳己被生长的细胞所占滿，细生长的底物面枳己被生长的细胞所占滿，细 胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。细胞数目胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。细胞数目 不再增加时，即达细胞生长的饱和密度不再增加时，即达细胞生长的饱和密度 特点特点 (1)(1)细胞数量细胞数量 细胞达细胞达饱和密度饱和密度 密度抑制密度抑制 停止生长原因停止生长原因:细胞数量多、生长细胞数量多、生长地区占满地区占满、营养消耗营养消耗、培养液中代谢、培养液中代谢废物积聚渐多废物积聚渐多 细胞停止生长细胞停止生长。即使经常更换培养液，。即使经常更换培养液，细胞也会变性细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡从生长基质表面脱落、死亡 唯有唯有进行进行传代传代方可缓解方可缓解特点特点 (2)(2)细胞活动小细胞活动小,细胞膜的活动小细胞膜的活动小(3)(3)生长组分下降生长组分下降:010%(4)(4)及时转代及时转代 若细胞若细胞已中毒已中毒，即使，即使传代传代，也会也会影响下一代细胞影响下一代细胞的功能状况的功能状况 培养细胞的生长曲线培养细胞的生长曲线培养细胞都可在培养细胞都可在接种以后接种以后的的不同培养时间不同培养时间，计数计数培养物培养物的的细胞数量细胞数量(一般以细胞密度一般以细胞密度代替代替)，绘制出，绘制出 时间时间密度曲线密度曲线，即培养即培养细胞细胞的的生长曲线生长曲线不同种类的细胞的生长曲线各不同种类的细胞的生长曲线各有其特点，可反映有其特点，可反映细胞的生物学特征细胞的生物学特征
