血型分子诊断技术进展与应用.ppt

血型分子诊断技术进展与应用血型分子诊断技术进展与应用主要内容主要内容红细胞血型系统分子诊断红细胞血型系统分子诊断红细胞血型系统分子基础红细胞血型系统分子基础ABOABO血型系统血型系统RhRh血型系统血型系统H H血型系统血型系统(类孟买型类孟买型)红细胞血型系统分子诊断技术及其应用红细胞血型系统分子诊断技术及其应用小结小结有关分子生物学概念有关分子生物学概念点突变点突变同义突变同义突变无义突变无义突变有义突变有义突变起始密码突变起始密码突变缺失缺失插入插入重排重排有关分子生物学概念有关分子生物学概念基因结构异常或表达异常基因结构异常或表达异常点突变点突变插入插入缺失缺失易位和重排易位和重排拷贝数扩增拷贝数扩增DNADNA多态性多态性基因的检测基因的检测常见突变示意图常见突变示意图ATG CGG TAG CGT AGT CTGATG CGA TAG CGT AGT CTGATA CGG TAG CGT AGT CTGATG CGGG TAG CGT AGT CTGATG CG TAG CGT AGT CTG新等位基因形成新等位基因形成红细胞血型系统红细胞血型系统4040个基因个基因12501250个个等位基因等位基因(截止截止20122012年年5 5月月1212日日)参见参见Blood Group Antigen Gene Mutation Blood Group Antigen Gene Mutation DatabaseDatabase红细胞血型分子机制红细胞血型分子机制点突变点突变u同义突变、无义突变、同义突变、无义突变、有义突变、起始密码突变、有义突变、起始密码突变、拼接接受位点拼接接受位点插入插入缺失缺失基因重组（基因重组（RHD/RHCE）基因部分重复基因部分重复http:/=bgmut/systemsABOABO血型分子生物学研究血型分子生物学研究19901990年年YamamotoYamamoto等首次克隆等首次克隆基因定位于染色体基因定位于染色体9q349q34ABOABO基因基因cDNAcDNA，其分子量为，其分子量为41,000 Dalton41,000 Dalton，DNADNA长度为长度为1062bp1062bpABOABO血型系统为三复等位基因，有血型系统为三复等位基因，有A A、B B、O O三个基因三个基因ABOABO基因包括基因包括7 7个外显子个外显子，长度大于，长度大于18kb18kb大多数编码序列位于大多数编码序列位于第第6 6和和7 7外显子外显子ABOABO基因示意图基因示意图常见等位基因常见等位基因A A和和B B基因基因 编码的蛋白都是编码的蛋白都是353353个氨基酸，个氨基酸，O O基因编码的蛋基因编码的蛋白只有白只有 115 115个氨基酸个氨基酸A101A101、A102A102、B101B101、O01O01、O02O02A101A101作为参考序列作为参考序列A102A102等位基因等位基因 C467T(Pro-Leu)C467T(Pro-Leu)B101B101基因在基因在297297、526526、657657、703703、796796、803803、930930、10961096位位有有8 8个核苷酸与个核苷酸与A101A101基因不同基因不同但只有但只有526526、703703、796796、803803四个核苷酸的变化造成了氨基酸序列四个核苷酸的变化造成了氨基酸序列的变化（的变化（A101A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，B101B101依次是甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和丙氨酸）依次是甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和丙氨酸）O01O01基因在基因在261261位的位的G G缺失缺失,提前终止提前终止ABOABO亚型频率分布亚型频率分布ABOABO血型中存在血型中存在ABOABO亚型亚型临床输血和献血者检测中常见临床输血和献血者检测中常见440617440617份份A A亚型亚型2222份份AxB 11AxB 11例，例，AelB 3AelB 3例，例，Ax 3Ax 3例，例，Ael 2Ael 2例，例，Amh 2Amh 2例，例，A A3 3 1 1例例B B亚型亚型4141份份Bx11Bx11例，例，B B3 39 9例，例，ABx7ABx7例，例，ABAB3 3 5 5例，例，Bel3Bel3例，例，Bm 2Bm 2例，例，ABel 1ABel 1例，例，ABend 1ABend 1例，例，ABm 1ABm 1例，例，Bend 1Bend 1例。例。B(A)1B(A)1例例CisAB2CisAB2例例A A2 2 14 14例例A A2 2B 35B 35例例引自中国输血杂志引自中国输血杂志20062006，1919（1 1）：）：2525ABOABO亚型的分子研究亚型的分子研究通通过过检检测测261261、526526、703703、796796、803803位位的的核核苷苷酸酸可以确认大多数典型的可以确认大多数典型的ABOABO血型的基因型血型的基因型近近年年来来对对血血清清学学分分类类的的ABOABO血血型型亚亚型型抗抗原原，应应用用PCRPCR、DNADNA测测序序等等技技术术，在在核核苷苷酸酸和和酶酶蛋蛋白白氨氨基基酸酸序列水平上进行研究序列水平上进行研究结结果果表表明明：原原为为同同一一亚亚型型的的抗抗原原存存在在异异质质性性，即即血血清清学学上上同同一一亚亚型型，在在核核苷苷酸酸和和酶酶蛋蛋白白氨氨基基酸酸序序列列水水平平上上有可能存在差异。有可能存在差异。几几个个位位点点以以外外的的核核苷苷酸酸变变化化引引起起的的ABOABO血血型型亚亚型型常常会会引起检测结果的偏差引起检测结果的偏差发现的等位基因数为发现的等位基因数为290290个（个（20122012年年0505月月2222日）日）A A等位基因等位基因可简要分为可简要分为7 7大类等位基因大类等位基因A1A1、A2A2、A3A3、AxAx、AelAel、AwAw、AmAmA101A101等位基因序列作为参照标准等位基因序列作为参照标准A102A102(C467T)(C467T)（在中国人群中比例大于（在中国人群中比例大于A101A101)A103A103(C467T,C564T)(C467T,C564T)A104A104(A297G)(A297G)A105A105(A297G,B-O1(A297G,B-O1重组重组)A106A106(B-O02(B-O02重组重组)A205(A1009G)A205(A1009G)B B等位基因型等位基因型可简要分为可简要分为5 5大类等位基因大类等位基因B1B1、B3B3、BxBx、BelBel、BwBwB B等位基因中等位基因中297297、703703、796796、803803位基本恒定位基本恒定B101-B101-B118B118B101B101:A297G;:A297G;C526GC526G;C657T;G703A;C796A;G80;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096A3C;G930A;G1096AB301-B308B301-B308B301B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A,:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A,C1054TG803C,G930A,G1096A,C1054TO O等位基因等位基因O01O01O74O74 大多数大多数261nt261nt缺失，缺失，1313个个261nt261nt不缺失不缺失O01O01:261delG:261delGO02O02:261delG:261delG、T646AT646A、G681TG681T、C771TC771T、G829AG829A人群中常见人群中常见003003:261G261G、A297G,C526G,G802AA297G,C526G,G802AO50O50CisABCisAB和和B(A)B(A)等位基因等位基因CisAB01-CisAB01-0606CisAB01CisAB01:C467T,G803C:C467T,G803CCisAB02CisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C,:C526G,C657T,G703A,G803C,B(A)01-06B(A)01-06B(A)B(A)型型单单克克隆隆试试剂剂应应用用于于临临床床后后，抗抗A A试试剂剂偶偶尔尔与与原原定定为为B B型型的的红红细细胞胞发发生生反反应应，这这类类含含有有大大量量B B抗抗原原极少极少A A抗原的红细胞称之为抗原的红细胞称之为B(A)B(A)型型B(A)01B(A)01:A297G,C526G,796A,G803C,G930A,G1096A:A297G,C526G,796A,G803C,G930A,G1096AB(A)02B(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A,:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096AC796A,G803C,G930A,G1096A实验室发现的实验室发现的ABOABO等位基因等位基因A208 allele*C467T;G539CA208 allele*C467T;G539CA210 allele*A210 allele*268TC;467CT A211 allele*A211 allele*266CT;467CT B112 allele*allele*297AG;526CG;559CT;657CT;703GA;796CA;803GC;930GA B305 allele*allele*297AG;425TC;526CG;657CT;703GA;796CA;803GC;930GA B307 allele*allele*297AG;410CT;526CG;657CT;703GA;796CA;803GC;930GA Bw12 allele*C278TBw12 allele*C278TCisAB05 allele*CisAB05 allele*A297G;C526G;C657T;G703A;C 796A;G930A O61 alleleallele*261del 743CABO基因诊断PCR-SSPPCR-RFLPPCR-SSOPCR-SSCPPCR-SBT261G干扰干扰正反定型不一致正反定型不一致ABOABO亚型分子机制和诊断亚型分子机制和诊断凝集强度改变凝集强度改变正反定型不一致正反定型不一致点突变为主点突变为主PCR-SSP261GPCR-SBTSNP(单核苷酸多态性单核苷酸多态性)ABOABO亚型分子机制和诊断亚型分子机制和诊断PCR-SBTPCR-SBT常见为常见为6-76-7外显子扩增外显子扩增双向测序双向测序存在风险：扩增引物存在风险：扩增引物SNPSNP多态性位点在其它位置多态性位点在其它位置其它机制：表观遗传、其它其它机制：表观遗传、其它ABOABO亚型分子机制和诊断亚型分子机制和诊断PCR-SBTPCR-SBT1-71-7外显子扩增技术外显子扩增技术和策略和策略全长全长18kb18kb一般一般3 3对引物以上对引物以上外显子上的突变外显子上的突变ATGATG位置突变位置突变其它机制？其它机制？ABOABO亚型分子机制和诊断亚型分子机制和诊断基层实验室如何有效获取信息基层实验室如何有效获取信息血清学结果血清学结果家系分析家系分析保存抗凝全血保存抗凝全血-20以下以下寻求寻求分子诊断实验室帮助分子诊断实验室帮助RhRh血型基因血型基因基因位于基因位于1 1号染色体短臂上，即号染色体短臂上，即1P34361P3436两两个个基基因因：RHDRHD编编码码D D抗抗原原，RHCERHCE编编码码CcEeCcEe抗原抗原RHDRHD和和RHCERHCE基因同源性高达基因同源性高达96%96%以上以上RHDRHD和和RHCERHCE基因均有基因均有1010个外显子个外显子RHDRHD基基因因第第1 1、2 2、8 8、1010外外显显子子的的编编码码序序列列与与RHCERHCE的相对应序列相同的相对应序列相同RHDRHD基基因因第第3 3、4 4、5 5、6 6和和第第9 9外外显显子子序序列列与与RHCERHCE基因有区别基因有区别两个两个RHRH基因紧密连锁，相隔基因紧密连锁，相隔30000bp30000bp两个基因两个基因的的33末端面对面末端面对面两个基因之间有一个独立的基因两个基因之间有一个独立的基因SMP1SMP1RHDRHD和和RHCERHCE两两个个基基因因之之间间以以及及外外侧侧分分别别有有1 1个个RhesusRhesus盒盒SMP1SMP1基因距中间一个基因距中间一个RhesusRhesus盒下游仅盒下游仅15bp15bpRHCERHCE和和RHDRHD基因组成示意图基因组成示意图1p34-p36RhRh血型等位基因血型等位基因RHAGRHAGRHDRHDRHCERHCE突变和缺失、基因转换、基因重组突变和缺失、基因转换、基因重组RHDRHD 218 218RHCERHCE 104 104RHAGRHAG 23 23RHDRHD等位基因等位基因RhDRhD阳性阳性正常正常RhDRhD阳性阳性弱弱D(weak D)D(weak D)部分部分D(partial D)D(partial D)DelDelRhDRhD阴性阴性RHDRHD基因缺失基因缺失RHDRHD基因基因功能丧失功能丧失部分弱部分弱D D的分子突变点的分子突变点RHD weak D type 1RHD weak D type 1 T809G T809G C5G;T809G C5G;T809GRHD weak D type 2RHD weak D type 2 G1154A G1154ARHD weak D type 3RHD weak D type 3 C8G C8GRHD weak D intron 55A intron3 5 G5ARHD weak D type33(Taiwan1)G520ARHD weak D type Taiwan2 T809ARHD weak D type 51 A594T;C602GRHD weak D type 52 92TC RHD weak D type 53 T740G分子机制分子机制碱基突变碱基突变缺失缺失mRNAmRNA拼接位点变异拼接位点变异部分部分D D分子机制分子机制Partial D Partial D 发现等位基因发现等位基因7070多个多个 -RHD Va 2RHD Va 2 T667G;G697C;G712A;G1273C T667G;G697C;G712A;G1273C RHD Va 3RHD Va 3 G697A G697A RHD Va 4RHD Va 4 hybrid D(1-4)CE5 D(6-10)hybrid D(1-4)CE5 D(6-10)RHD VI type IRHD VI type I hybrid(D1-3)CE(4,5)D(6-10)hybrid(D1-3)CE(4,5)D(6-10)RHD VI type IIRHD VI type II hybrid D(1-3)CE(4-6)D(7-10)hybrid D(1-3)CE(4-6)D(7-10)RHD VI type IIIRHD VI type III hybrid D(1,2)CE(3-6)D(7-10)hybrid D(1,2)CE(3-6)D(7-10)RHD VI type IVRHD VI type IV hybrid D1 Ce(2/3-5)D(6-10)hybrid D1 Ce(2/3-5)D(6-10)分子机制分子机制基因交换基因交换RHD-CE-DRHD-CE-D点突变点突变部分部分D D分子机制示意图分子机制示意图DelDel分子机制分子机制DelDel（D elutionD elution）亚洲人群常见亚洲人群常见RHD DEL(Cde)1 intron 3 G1ARHD DEL(Cde)2 G885TRHD DEL(Cde)3 intron 9 G1A;G1227ARHD DEL(Cde)4 intron 5 38delCTCTRHD DEL(Cde)5 1252insTRHD DEL(Cde)6 T1203ARHD Del(Cde)7 G3ARHD Del(Cde)8 C28TRHD Del(Cde)9 T53CRHD Del(Cde)10 T251CRHD DEL T1222CRHD Del intron 8-9:del 1013RHD DEL exon8 del 995nt including 3intron7+exon8+5intron8RhDRhD阴性的机制阴性的机制不同不同RhRh阴性表现型频率不同阴性表现型频率不同RHDRHD阴性的可能机制阴性的可能机制RHDRHD基因缺失基因缺失RHDRHD基因发生改变基因发生改变RHD-CE-DRHD-CE-D融合基因融合基因RHDRHD基因的第基因的第3 3到到9 9外显子被外显子被RHCERHCE基因取代基因取代RHDRHD阴性个体中约阴性个体中约1/31/3具有完整的具有完整的RHDRHD基因基因非洲非洲D D阴性个体具有阴性个体具有RHDRHD（假基因）（假基因）RHCERHCE等位基因等位基因RHCERHCE等位基因等位基因104104个个正常正常RHCERHCERHce 48C RHce 48C RHCE RHCE G48CG48CRHCE(1)D(2-10)RHCE(1)D(2-10)RHCERHCE(1)D(2-10)(1)D(2-10)RHCE RHCE D-Chinese D-Chinese RH(D1-9CE10)RH(D1-9CE10)RH(CE1 D2-7 CE8-10)RH(CE1 D2-7 CE8-10)hybrid CE(1)D(2-7)hybrid CE(1)D(2-7)CE(8-10)CE(8-10)RHCE 685-687delRHCE 685-687del 685-687delAGA 685-687delAGA RHCERHCE null amorph 2 Intron 4:G1T null amorph 2 Intron 4:G1T 9 9例弱例弱D D样本样本RHD 845A 5RHD 845A 5例（例（RHD weak D type 15RHD weak D type 15）RHD 1227A 3RHD 1227A 3例（例（D-el(CDe);minimal expression of D antigen;）RHD 1013C 1RHD 1013C 1例（例（RHD weak D type 24RHD weak D type 24）1010例部分例部分D D样本样本Dva(Kou)1Dva(Kou)1例例Dva(Hus)1Dva(Hus)1例例DVa-like(YH)1DVa-like(YH)1例例DVI type III 7DVI type III 7例例Molecular basis of D variants in Chinese persons.Transfusion.2007;47(3):471-7 本实验室部分检测结果本实验室部分检测结果RhRh表型表型 样本量样本量 RHD+RHD+/RHD+RHD+RHD+RHD+/RHD-RHD-RHD-RHD-/RHD-RHD-RhDRhD阳性阳性198198186186（93.94%93.94%）1212（6.06%6.06%）0 0（0 0）Weak DWeak D32323 3（9.37%9.37%）2929（93.63%93.63%）0 0（0 0）RhDRhD阴性阴性 2082081010（4.81%4.81%）5353（25.48%25.48%）145145（69.71%69.71%）RHD血型分子诊断血型分子诊断RhD阴性阴性多重多重PCR技术技术FQ-PCRPCR-RFLPD VariantPCR-SSP测序技术测序技术RHD血型分子诊断血型分子诊断分子机制复杂分子机制复杂RhDRhD阴性分子机制阴性分子机制基因交换基因交换RHD-CE-DRHD-CE-D疑难标本疑难标本单一技术难以判定单一技术难以判定多种技术并存多种技术并存血清学结果血清学结果H H血型系统血型系统H H抗原与抗原与ABOABO血型，血型，LewisLewis血型密切相关，属血型密切相关，属于于HhHh血型系统（血型系统（ISBT018ISBT018）其它血型系统血清学特性分子机制点突变基因重组PCR-SSP基因芯片其它血型系统罕见表型罕见表型血清学特性血清学特性基因定位基因定位测序技术测序技术体外表达体外表达红细胞血型系统分子诊断技术的应用红细胞血型系统分子诊断技术的应用红细胞血型的诊断红细胞血型的诊断人群遗传的分析人群遗传的分析谱细胞血型的诊断谱细胞血型的诊断罕见表型分子机制研究罕见表型分子机制研究疑难血型的判断疑难血型的判断多次输血后的血型检测多次输血后的血型检测产前血型的诊断产前血型的诊断红细胞血型系统分子诊断技术的应用红细胞血型系统分子诊断技术的应用罕见表型罕见表型多次输血病人多次输血病人ABOABO、RhDRhD血型的不一致血型的不一致RhDRhD变异体变异体弱表达的基因情况弱表达的基因情况RHDRHD杂合度杂合度筛选稀有系统（抗体缺乏）筛选稀有系统（抗体缺乏）谱细胞谱细胞红细胞血型中采用的技术红细胞血型中采用的技术PCR-RFLPPCR-RFLPPCR-SSPPCR-SSP多重多重PCRPCR技术技术PCR-SBTPCR-SBTPCR-SSCPPCR-SSCPPCR-RQPCR-RQ基因芯片基因芯片方法的优缺点方法的优缺点与血清学方法的比较与血清学方法的比较红细胞血型系统基因分型技术红细胞血型系统基因分型技术 PCR-RFLP(PCR-RFLP(限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性)通过通过PCRPCR扩增出包含突变位点的特定片段扩增出包含突变位点的特定片段利用限制性内切酶消化利用限制性内切酶消化片段经凝胶电泳片段经凝胶电泳不同的片断大小检测便能确认基因型不同的片断大小检测便能确认基因型方法特性方法特性操作较简单操作较简单酶切过程需要控制酶切过程需要控制PCR-RFLPPCR-RFLP复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型.中华医学遗传学杂志,1999年第2期 复合复合PCR PCR 技术在技术在ABO ABO 血型基因血型基因分型中的应用分型中的应用,北京医学北京医学2007 2007 年第年第29 29 卷第卷第2 2 期期PCR-SSPPCR-SSP利用利用33碱基特性碱基特性分别分别设计设计一系列序列一系列序列特异性引物特异性引物直接扩增出目的基因片段直接扩增出目的基因片段通过凝胶电泳观察通过凝胶电泳观察方法特性方法特性简单快捷简单快捷易于操作易于操作基于已知序列基于已知序列PCR-SSCPPCR-SSCP选择性扩增基因片段选择性扩增基因片段加热或用变性剂解开加热或用变性剂解开DNADNA双链双链由由于于等等位位基基因因的的核核苷苷酸酸顺顺序序的的不不同同，二二级结构产生差异级结构产生差异在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳中中电电泳泳迁迁移移率率不不同同分析电泳带型即可区别开等位基因分析电泳带型即可区别开等位基因DNADNA测序法测序法通通过过PCRPCR扩扩增增基基因因的的主主要要片片段段，然然后后对对产产物物进进行行序序列列分分析析测测定定，分分析析发发生生突突变变的的碱碱基基便可确认血型便可确认血型血型及其亚型的分子基础血型及其亚型的分子基础本方法结果本方法结果准确可靠准确可靠需要特殊的仪器设备需要特殊的仪器设备操作烦琐，成本高操作烦琐，成本高测序技术测序技术测序技术测序技术双脱氧终止法双脱氧终止法化学降解法化学降解法高通量测序高通量测序Partial sequence in exon 6Partial sequence in exon 6O01 alleleBw12 allelevA novel allele基因芯片技术基因芯片技术20052005年年Transfusion 45(5):654-9Transfusion 45(5):654-9 Transfusion 45(5):667-679 Transfusion 45(5):667-679高通量高通量同时分析多个系统同时分析多个系统多个位点多个位点(等位基因）等位基因）快速可靠快速可靠可可自动化自动化国外产品为主国外产品为主实时荧光技术实时荧光技术(PCR-RQ)(PCR-RQ)Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe phenotype Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe phenotype from maternal plasma with real-time polymerase from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction.Transfusion and Apheresis chain reaction.Transfusion and Apheresis Science 27(2002)217223Science 27(2002)217223实时定量荧光基团特异性探针产前诊断RT-PCRRT-PCR逆转录逆转录mRNAmRNA和和cDNAcDNA全部编码序列全部编码序列无内含子区域无内含子区域功能研究功能研究克隆克隆体外表达体外表达突变功能突变功能RT-PCR to amplify the full length RT-PCR to amplify the full length cDNA of cDNA of RHDRHD2000bp1000bp 1 2 MPrimer:RHF&RHR国内红细胞血型系统基因诊断情况国内红细胞血型系统基因诊断情况基因分型方法的建立基因分型方法的建立分子遗传多态性检测分子遗传多态性检测罕见表型分析罕见表型分析RHDRHD基因基因ABOABO血型亚型血型亚型类孟买型类孟买型其他其他功能表达功能表达红细胞血型基因分型红细胞血型基因分型不能完全取代传统的血清学方法，不能完全取代传统的血清学方法，其原因有：其原因有：血清学方法快速、简单，易于操作血清学方法快速、简单，易于操作血清学试验比血清学试验比PCRPCR方法成本低方法成本低DNADNA技术不能用于抗体筛选，至少目前尚没有合适技术不能用于抗体筛选，至少目前尚没有合适的方法的方法DNADNA技术只能预测血型表现型技术只能预测血型表现型基因分型方法：基因分型方法：样本来源更广，保存时间更长样本来源更广，保存时间更长稀有表型鉴定稀有表型鉴定 、疑难样本鉴定、阐明分子机理等、疑难样本鉴定、阐明分子机理等目前目前DNADNA分型结果应该与血清学结果相互补充分型结果应该与血清学结果相互补充血型分子诊断发展血型分子诊断发展小结：小结：血型分子机制血型分子机制ABOABORHDRHDFUT1FUT1诊断技术诊断技术血型分子诊断发展血型分子诊断发展高通量技术高通量技术表观遗传表观遗传RNARNA干扰干扰等位基因数量等位基因数量分子机制分子机制表达调控表达调控谢谢各位同仁的支持！不当之处请指正