6流式细胞术的质量控制和影响因素.pptx

一、标本的采集和固定方法的质量控制一、标本的采集和固定方法的质量控制 标本采集是十分重要的环节标本采集是十分重要的环节，在标本的采在标本的采集过程集过程，需注意：，需注意：手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时材时，要避免出血坏死组织要避免出血坏死组织。标本采集后要及时固定或深低温保存标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶以免组织发生自溶，DNA降解降解，而造成而造成测试结果的误差测试结果的误差。固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度度。 例如例如70%的乙醇固定比的乙醇固定比75%以上的以上的浓度固定效果好浓度固定效果好，因为因为高浓度的乙醇常高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致致使细胞内的物质固定不良使细胞内的物质固定不良。 有作者分析研究了自溶对有作者分析研究了自溶对DNA测定测定的影响的影响，发现自溶的组织细胞常出现假发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体性异倍体，且不固定的组织细胞随时间且不固定的组织细胞随时间的延长的延长，DNA含量呈梯度降低含量呈梯度降低 根据检测的目的根据检测的目的，选择什么类型的选择什么类型的固定剂固定剂，对流式检测质量也有显著的影对流式检测质量也有显著的影响响。 例如细胞例如细胞DNA的分析的分析，使用醇类固使用醇类固定剂较好而不选择定剂较好而不选择醛醛类固定剂类固定剂，醛，醛类固类固定剂明显影响细胞定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度荧光发射强度。实验证明实验证明，醛，醛类固定剂对插入性荧光染类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用料与核酸的结合有很强的干扰作用，其其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右左右。 如果作流式免疫研究工作如果作流式免疫研究工作，采用新采用新鲜组织是最好的选择鲜组织是最好的选择。在不能及时检测在不能及时检测又没有低温保存条件时又没有低温保存条件时，要根据所测物要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表在膜表面的抗原物质面的抗原物质，以以醛醛类固定剂为宜类固定剂为宜，尽尽管管醛醛类固定剂产生的非特异性荧光较强类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类但不宜采用醇类固固定剂定剂，因醇类固定剂因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失失，失去标记的位点失去标记的位点。 如所测抗原物质在细胞内如所测抗原物质在细胞内，可以使用可以使用醇类固定剂醇类固定剂，这种固定方法简便易行这种固定方法简便易行，无无需特殊低温冷冻条件需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱在一般冰箱(0-4)放置即可放置即可，能很好的保持细胞形态和生物能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。化学成分不发生变性。 二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制 人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料单分散细胞材料，其中的细胞成分在生其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态理状态下呈单分散状态，它是流式分析它是流式分析最合适的样品来源最合适的样品来源。 二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制 全血中含有多种有形成分全血中含有多种有形成分，流式细流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象胞检测是以某一群细胞为检测对象，因因此在检测前须将所测的某群细胞成分分此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来离出来。例如例如，以淋巴细胞以淋巴细胞DNA定量分定量分析为例析为例，就须把淋巴细胞分离出来就须把淋巴细胞分离出来，而而将其他有核细胞或红细胞去除将其他有核细胞或红细胞去除，对于血对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤离心速度造成血小板膜的损伤，出现血出现血小板凝集小板凝集 新鲜实体组织单细胞样品的制备新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料实体组织是流式分析工作的主要材料来源来源，但对其分散单细胞样品的技术但对其分散单细胞样品的技术和方法和方法，仍存在着很多问题仍存在着很多问题，仍需大仍需大量的探索工作量的探索工作。就目前就目前，国内外对实国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法用的又通用方法，甚至同样组织甚至同样组织，用用于不同的实验目的于不同的实验目的，就需要不同的方就需要不同的方法处理法处理，或者每一种组织就是一个单或者每一种组织就是一个单独的问题独的问题 因此必须根据实际情况因此必须根据实际情况，去选择去选择合适有效的单分散方法合适有效的单分散方法，选用的方法选用的方法必须达到细胞产量高必须达到细胞产量高，细胞损伤小的细胞损伤小的目标目标，但实际工作中达到这个目标是但实际工作中达到这个目标是困难的困难的，多年来对于实体组织的分散多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法解聚多采用酶学法，化学法、机械物化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等理方法以及低渗脱核方法等，根据各根据各种组织的特点种组织的特点，以及实验目的的不同以及实验目的的不同，可选择不同的方法。可选择不同的方法。 选则酶学方法时选则酶学方法时，应注应注意意选择酶类型选择酶类型的问题的问题，含有大量结缔组织的含有大量结缔组织的，选择选择胶原酶好胶原酶好，不宜选择胃蛋不宜选择胃蛋白白酶或酶或胰胰酶酶。并要注意酶的活性条件和影响因素并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂要注意酶的溶剂，消化时间消化时间，pH值值，浓度等对酶活性的影响浓度等对酶活性的影响酶学方法分散组织都有一定的应用限酶学方法分散组织都有一定的应用限制制，特别用于流式免疫荧光实验时特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果从而影响分析结果，由于酶学方法分由于酶学方法分散下来的细胞产量低散下来的细胞产量低，用组织较多用组织较多，还要注意酶的纯度还要注意酶的纯度，活性单位活性单位，以及以及生产厂家对酶的污染生产厂家对酶的污染化学方法化学方法，往往单独应用分散组织效往往单独应用分散组织效果不理想果不理想，应与酶学方法综合使用应与酶学方法综合使用，分分散效果更佳。散效果更佳。 机械方法机械方法，常采用剪碎常采用剪碎，网搓研磨网搓研磨，细针抽吸等细针抽吸等，对细胞损伤大对细胞损伤大，产生的细产生的细胞碎片多胞碎片多，细胞团块多细胞团块多，在使用机械法在使用机械法时时，要给于组织适当的压力要给于组织适当的压力，这种适当这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。人员来操作。 低渗方法低渗方法，其溶液是一种低渗液体其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放使细胞核自行释放出来出来，是一个裸核悬液样品是一个裸核悬液样品，本方法简本方法简便便，但要避免脱核时间过长但要避免脱核时间过长，造成核膨造成核膨胀碎裂。胀碎裂。 以上几种方法是目前对实体组织解以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法聚常用的方法，往往不是单用往往不是单用，常常是常常是一种或二种方法的结合使用一种或二种方法的结合使用，总的来说总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困对实体组织分散为单细胞还存在很多困难难，因此还需要深入探讨流式样品的制因此还需要深入探讨流式样品的制备技术备技术，制备出完整细胞产量高制备出完整细胞产量高，细胞细胞损伤小的合格悬液损伤小的合格悬液 , 获得更好的流式检获得更好的流式检测结果。测结果。 三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制 石蜡包埋组织标本的材料选择石蜡包埋组织标本的材料选择，应经应经病理医师仔细检病理医师仔细检查，查，选取无自溶选取无自溶，坏死坏死的组织对肿瘤组织标本的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组选取含肿瘤组织细胞丰富的区域织细胞丰富的区域，且经病理形态或细且经病理形态或细胞学核实病理诊断胞学核实病理诊断三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制 切取适当厚度的石蜡组织片切取适当厚度的石蜡组织片，大量研大量研究证明究证明，切取切取40-50m厚度的切片是适宜厚度的切片是适宜的的，过厚的组织片消化费时过厚的组织片消化费时，消化下来消化下来的细胞数少的细胞数少，过薄的切片可产生大量的过薄的切片可产生大量的细胞碎片细胞碎片，影响检测结果影响检测结果，使肿瘤异倍使肿瘤异倍体的检出率减少体的检出率减少，我们研究了石蜡切片我们研究了石蜡切片不同厚度不同厚度(5,10,20,30,40, 50m)对流式分对流式分析析DNA的的影响影响，发现较薄的切片造成碎发现较薄的切片造成碎片较多片较多,噪音增加噪音增加,组方图的基线提高组方图的基线提高,影响影响倍体分析的精度倍体分析的精度 在组织脱蜡的过程中在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱一定将蜡脱净净，残留的石蜡可影响酶的消化活性残留的石蜡可影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯，加入加入100%乙醇乙醇，如果无絮状物浮起如果无絮状物浮起，表示表示蜡已脱净蜡已脱净 梯度酒精梯度酒精(100% 70% 50%)水化要水化要充分充分, 使组织还原到与新鲜组织相似的使组织还原到与新鲜组织相似的状态。状态。 消化酶液要掌握适当的浓度、消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等值、温度等，不造成酶的活性降低为宜不造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要消化时间很重要，时间短细胞消化不下时间短细胞消化不下来来，时间长时间长，消化下来的细胞又被破坏消化下来的细胞又被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用常规使用0.5%胃蛋白酶胃蛋白酶（PH 1.5） 石蜡包埋组织的单细胞制备方法的石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立建立，使流式细胞术在医学研究中得使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用到更广泛的应用，但仍存在一些问题但仍存在一些问题有待进一步解决有待进一步解决，主要存在问题如下主要存在问题如下：样品中的碎片较多样品中的碎片较多，所测得的所测得的DNA组组方图质量不及新鲜组织好方图质量不及新鲜组织好，组方图的组方图的峰位较宽峰位较宽，CV值偏大。值偏大。异倍体率减少异倍体率减少，由于组方图细胞峰由于组方图细胞峰CV值较大值较大，一些近于二倍体的一些近于二倍体的DNA异倍异倍体峰被掩盖体峰被掩盖 石蜡包埋组织的单细胞制备方法的石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立建立，使流式细胞术在医学研究中得使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用到更广泛的应用，但仍存在一些问题但仍存在一些问题有待进一步解决有待进一步解决，主要存在问题如下主要存在问题如下：S期细胞百分比不如新鲜组织的期细胞百分比不如新鲜组织的S期计期计算精确算精确，S期细胞的计算偏高期细胞的计算偏高，这仍然这仍然与与CV值较大有关值较大有关 DNA二倍体标准不稳定二倍体标准不稳定 Schutter等发现用新鲜正常组织的等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞二倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含含量量(例如例如，鸡红细胞鸡红细胞，鳟，鳟鱼血细胞等鱼血细胞等)作为作为石蜡包埋组织细胞石蜡包埋组织细胞DNA含量的标准不适含量的标准不适用用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳且样品间的荧光强度不稳定定 DNA二倍体标准不稳定二倍体标准不稳定 对存档中的石蜡包埋组织材料对存档中的石蜡包埋组织材料，可可以采用正常组织石蜡包埋标本以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一作为一个外参的二倍体标准个外参的二倍体标准，但要求采用的外但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品样品(例如鸡血细胞等例如鸡血细胞等)四、脱落细胞样品的采集四、脱落细胞样品的采集 脱落细胞样品的采集要保证足够的脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数细胞数，在临床实际工作中在临床实际工作中，可以收集可以收集到大量自然脱落的细胞标本到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞这些细胞标本经简单处理后标本经简单处理后，即可得到较好的单即可得到较好的单分散细胞分散细胞，例如胸腹水例如胸腹水，内镜刷检细胞内镜刷检细胞，膀脱冲洗液膀脱冲洗液等等四、脱落细胞样品的采集四、脱落细胞样品的采集 这些材料得到的流式结果这些材料得到的流式结果，要谨慎要谨慎的分析解释结果的生物学意义的分析解释结果的生物学意义。因这些因这些材料获得材料获得的的结果常出现结果常出现假假阴性或假阳性阴性或假阳性。原因是原因是其中的其中的白白细胞常有变性细胞常有变性，且样品且样品细胞数量少细胞数量少。制备出一个合格的单细胞制备出一个合格的单细胞样品样品，其细胞数要求在其细胞数要求在1106/ml，其其杂质碎片团块应小于杂质碎片团块应小于2%以下以下，否则应否则应放弃检测放弃检测，对肿瘤细胞对肿瘤细胞DNA异倍体的异倍体的分析样品中分析样品中，至少应有至少应有20%的肿瘤细胞的肿瘤细胞存在存在，(因占主峰因占主峰1/5以上的异倍体峰才以上的异倍体峰才可确认为异倍体可确认为异倍体) 五、细胞悬液荧光染色的质量控制五、细胞悬液荧光染色的质量控制 单细胞悬液样品荧光染色对流式定量单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要分析的精度很重要。目前常使用的荧光染目前常使用的荧光染料有料有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效关系效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响因素的影响，以致造成不正确的测定结果以致造成不正确的测定结果，了解荧光染色的影响因素了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧将有助于在荧光定量细胞学分析中光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误尽可能避免测量误差差，并进行有效的校正措施并进行有效的校正措施，如下的一些如下的一些常见影响因素需特别注意。常见影响因素需特别注意。 温度对荧光染色强度的影响温度对荧光染色强度的影响： 在一般情况下在一般情况下，环境温度的升高对荧环境温度的升高对荧光染色有明显的影响光染色有明显的影响。温度升高可造成溶温度升高可造成溶液粘滞性增加液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动溶剂和荧光染料分子的动力增大力增大，这就使荧光分子和其他分子之间这就使荧光分子和其他分子之间的相互碰撞几率增加的相互碰撞几率增加，使荧光猝灭的可能使荧光猝灭的可能性增加性增加。因此因此，影响了荧光分子发光量子影响了荧光分子发光量子产额产额 温度对荧光染色强度的影响温度对荧光染色强度的影响： 温度升高时温度升高时，荧光减弱荧光减弱，荧光减弱的荧光减弱的百分比称温度系数百分比称温度系数。就一般荧光物质而言就一般荧光物质而言，温度系数大约为温度系数大约为1%，如果温度在如果温度在20时时，一一般荧光染料即出现温度猝灭效应般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温随温度的升高度的升高，荧光猝灭作用越强荧光猝灭作用越强，以致造成以致造成完全猝灭完全猝灭，温度在温度在20以下以下，荧光分子发荧光分子发光量子产额的变化不明显光量子产额的变化不明显，基本上保持恒基本上保持恒量量。因此在荧光测定时要保持染色后的样因此在荧光测定时要保持染色后的样品在适当低温环境下品在适当低温环境下运行，运行，尽可能减少样尽可能减少样品的照射时间品的照射时间，有条件时应使样品观察室有条件时应使样品观察室做到恒温装置做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结会得到更好的荧光定量结果果2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例接比例关系：关系： 在溶液较稀时在溶液较稀时，荧光强度与浓度成荧光强度与浓度成正正比关系比关系，随浓度随浓度加加大大，荧光强度也增荧光强度也增大大，当荧光染料达到当荧光染料达到一一定浓度时定浓度时，如继如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加的增加，反而使荧光强度减低反而使荧光强度减低，这种因这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象现象称为浓度猝灭现象2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例接比例关系：关系： 因此在研究浓度与荧光强度关系时因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度浓度，还是曲线高峰后的浓度还是曲线高峰后的浓度(方法是减方法是减少溶液浓度少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓如荧光减弱则为高峰前浓度度)。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大响之大，因此要选择最合适的浓度因此要选择最合适的浓度，对对于荧光定量检测技术是极其重要的于荧光定量检测技术是极其重要的 3.pH 值对荧光发射强度的影响值对荧光发射强度的影响： 荧光分子在溶剂中处于离子化状态荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大影响极大，荧光分子发荧光分子发光光的最有利条件的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从从而通过染料分子本身所具有的斥力作用而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子都有自己合适的每一种荧光分子都有自己合适的pH值值4.其他一些影响荧光强度的因素其他一些影响荧光强度的因素： 像像醛醛类固定剂类固定剂(戊二戊二醛，醛，甲甲醛醛),可以可以干扰荧光染料与核酸分子的结合干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂像溶剂中的一些不发光的物质中的一些不发光的物质(如如溴溴化物化物、碘、碘化化物物、氨基苯氨基苯、硝基苯硝基苯、铁铁、银银离子离子等等)均均可造成荧光的猝灭现象可造成荧光的猝灭现象 六六、流式细胞分析资料处理的质量控制、流式细胞分析资料处理的质量控制 样品中的碎片杂质和团块过多样品中的碎片杂质和团块过多，所所测细胞数仅占测细胞数仅占20%以下以下，组方图的基线组方图的基线抬高抬高，尤其不能进行细胞周期分析尤其不能进行细胞周期分析，尽尽管目前有计算机的硬件删除或软件补偿管目前有计算机的硬件删除或软件补偿来消除碎片和团块的影响来消除碎片和团块的影响，也应放弃不也应放弃不作分析处理作分析处理六六、流式细胞分析资料处理的质量控制、流式细胞分析资料处理的质量控制 一个样品细胞数检测应在一个样品细胞数检测应在1万个细万个细胞胞(不包括碎片不包括碎片、杂质杂质、团块团块)。如果单独如果单独作作DNA倍体分析而不作细胞周期的处理倍体分析而不作细胞周期的处理，小于小于1万个细胞也可以万个细胞也可以，但异倍体细胞占但异倍体细胞占总细胞数的总细胞数的10%以下时以下时，不可盲目下结不可盲目下结论论，至少异倍体细胞占总细胞的至少异倍体细胞占总细胞的20%以以上上，可以确定异倍体的存在可以确定异倍体的存在 正常二倍体细胞组方图的正常二倍体细胞组方图的CV值大于值大于8%以上以上，应，应放弃细胞周期的分析放弃细胞周期的分析，但肿但肿瘤细胞瘤细胞CV值大于值大于8%，这与肿瘤细胞这与肿瘤细胞DNA异质性增大有关。异质性增大有关。 对于一个正常人体的二倍体细胞群对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/1期细胞占期细胞占85-90%左右左右，S+G2M细胞细胞占占10-15%，但在同一个体的不同正常组但在同一个体的不同正常组织织，细胞细胞DNA含量也有漂移含量也有漂移，在不同个在不同个体的同源组织也会出现体的同源组织也会出现10%的漂移的漂移 S期细胞期细胞可可作为评价肿瘤的增殖活性作为评价肿瘤的增殖活性指标。指标。大量报道认为大量报道认为，S期有明显的临床期有明显的临床预后意义预后意义，但但S期计算方面期计算方面容易产生容易产生误差误差,而造成评价而造成评价S期在肿瘤生物学行为不确切期在肿瘤生物学行为不确切性性 对于对于S期细胞计算较准确的方法期细胞计算较准确的方法，就就是分别作两次样品的检测是分别作两次样品的检测，加入加入DNA倍倍体标准样品检测一次体标准样品检测一次，不加二倍体标准的不加二倍体标准的样品检测一次样品检测一次，G0/1峰应是一个正态分布峰应是一个正态分布(或称高斯分布或称高斯分布)。但实际测量过程但实际测量过程,有部分有部分组方图有时会出现组方图有时会出现G0/1峰的右偏峰或脱尾峰的右偏峰或脱尾(Teiling)现象现象，或出现一个右或左侧的或出现一个右或左侧的峭峭峰峰 (Kurtosis)，造成造成S期细胞计算的不准期细胞计算的不准确性确性。对于这样峰位对于这样峰位，除了可用计算机软除了可用计算机软件加以消除外件加以消除外，可放弃可放弃S期的计算期的计算 DNA倍体标准的质量控制倍体标准的质量控制： DNA倍体的标准是根据正常二倍体细胞倍体的标准是根据正常二倍体细胞DNA含量的分布范围而确定的含量的分布范围而确定的，对于二对于二倍体的标准的选择倍体的标准的选择，应遵照如下原则应遵照如下原则： 采用同个体同源正常组织。采用同个体同源正常组织。 同种固定方法。同种固定方法。 相同的样品处理方法。相同的样品处理方法。 同样的染色方法同样的染色方法 , 同步染色。同步染色。 同样的仪器检测条件。同样的仪器检测条件。 正常二倍体细胞作为内标准正常二倍体细胞作为内标准。 在不具备同个体在不具备同个体，同源组织的情况同源组织的情况下下，可以使用鸡红细胞可以使用鸡红细胞，或其他生物或其他生物细胞为内参标准细胞为内参标准，作为计算倍体的标作为计算倍体的标准细胞准细胞，但这种标准细胞的使用但这种标准细胞的使用，仅仅限于新鲜组织倍体的判定限于新鲜组织倍体的判定，对于石蜡对于石蜡包埋组织倍体标准包埋组织倍体标准，解决的办法是将解决的办法是将正常组织与肿瘤组织同时包埋于一个正常组织与肿瘤组织同时包埋于一个石蜡组织块中石蜡组织块中，这样正常组织作为一这样正常组织作为一个二倍体内标准个二倍体内标准,能减少能减少DNA倍体分析倍体分析的误差。的误差。 假性异倍体的识别与排除假性异倍体的识别与排除： 假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤(Near diploid)或或DNA指数小于指数小于1.30以下的以下的异倍体肿瘤异倍体肿瘤。 假性异假性异倍倍体出现的原因主要有组织自体出现的原因主要有组织自溶造成或在组织固定前或期间溶造成或在组织固定前或期间，细胞细胞DNA出现变性出现变性(而非降解阶段而非降解阶段)，染色质结染色质结构发生变性构发生变性，与荧光染料结合增加或减少与荧光染料结合增加或减少，更多出现在异倍体细胞数仅占总测细胞数更多出现在异倍体细胞数仅占总测细胞数的的5-10%的情况下的情况下 对于二倍体为主峰的右侧出现的异对于二倍体为主峰的右侧出现的异倍体峰倍体峰，用用0.5%胃蛋胃蛋白白酶或酶或1%的的DNA酶酶消化消化3-5分钟分钟，如果再测仍然出现异倍体如果再测仍然出现异倍体峰可为真性异倍体峰可为真性异倍体，如果异倍体峰消失如果异倍体峰消失，则认为是假性异倍体则认为是假性异倍体。 对于二倍体峰左侧出现的异倍体峰对于二倍体峰左侧出现的异倍体峰(称亚二倍体称亚二倍体)要首先排除自溶的原因要首先排除自溶的原因。八、流式免疫学检测的质量控制八、流式免疫学检测的质量控制 在免疫荧光染色过程中常出现一些人为在免疫荧光染色过程中常出现一些人为非特异性荧光非特异性荧光，造成本底荧光过高造成本底荧光过高，出出现假阳性结果现假阳性结果，常见的原因有常见的原因有： 降低抗体非特异性结合的措施不够降低抗体非特异性结合的措施不够。 洗涤不充分洗涤不充分。 细胞重叠和凝集团块细胞重叠和凝集团块。 细胞碎片过多贴附在细胞上细胞碎片过多贴附在细胞上。 解决这些影响因素的方法解决这些影响因素的方法： 1 使动物血清蛋白等封闭非特异性结合位使动物血清蛋白等封闭非特异性结合位点点，荧光抗体染色后充分洗涤荧光抗体染色后充分洗涤。 2 减少重叠细胞和碎片减少重叠细胞和碎片。 3设对照样品设对照样品，与抗体来源的同型对照和与抗体来源的同型对照和荧光抗体的本底对照荧光抗体的本底对照 对于需要保存不能马上进行定量分对于需要保存不能马上进行定量分析的标本析的标本，在免疫荧光染色后在免疫荧光染色后，不固定不固定可以在可以在4放置放置48小时不出现荧光强度小时不出现荧光强度或标记阳性率降低或标记阳性率降低。时间更长时需要进时间更长时需要进行固定保存行固定保存，但固定方法要求方法步骤但固定方法要求方法步骤简单简单，固定液单一固定液单一，不明显影响细胞膜不明显影响细胞膜表面抗原的免疫荧光标记表面抗原的免疫荧光标记，细胞体积和细胞体积和荧光强度等荧光强度等，可保存较长时间可保存较长时间 较理想的固定剂为较理想的固定剂为1-4%的多聚甲的多聚甲醒缓冲液或醒缓冲液或4%的甲醒缓冲液的甲醒缓冲液(pH7.2)，实验证明实验证明，固定固定1-2个月个月，仍可得到较仍可得到较好定量分析结果好定量分析结果，对细胞膜内的抗原物对细胞膜内的抗原物质的免疫荧光检测质的免疫荧光检测，可用可用70%的的冷乙醇冷乙醇(4)固定可获得满意的检测结果固定可获得满意的检测结果