二、α-淀粉酶活力的测定2010优秀PPT.ppt

生物技术专业系统试验（四）生物技术专业系统试验（四）酶（蛋白质）工程试验酶（蛋白质）工程试验IIII二、二、-淀粉酶活力的测定淀粉酶活力的测定 -国家标准国家标准GB 8275-2009GB 8275-20091.1.目的意义目的意义 2.2.试验原理试验原理3.3.试剂和溶液试剂和溶液 4.4.仪器和器材仪器和器材5.5.试验方法试验方法 6.6.试验报告试验报告 7.7.思索题思索题1.1.目的意义目的意义淀粉是葡萄糖以淀粉是葡萄糖以-1,4-1,4糖苷键及糖苷键及-1-1，6 6糖糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。纺织工业的基本原料。淀粉酶淀粉酶(amylase)(amylase)是能够水解淀粉分子链中是能够水解淀粉分子链中的的-1,4-1,4糖苷键，将淀粉链切断成为短链糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，是淀粉粘度糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，是淀粉粘度快速下降的酶制剂。包括快速下降的酶制剂。包括-淀粉酶、淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。它们广泛存淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。它们广泛存在于动物界、植物和微生物界。在于动物界、植物和微生物界。除特殊的外，一般淀粉酶对于生的淀粉不除特殊的外，一般淀粉酶对于生的淀粉不起作用，只作用于糊化后的淀粉。不同来起作用，只作用于糊化后的淀粉。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。其中最重要源的淀粉酶，性质有所不同。其中最重要的淀粉酶是的淀粉酶是-淀粉酶。淀粉酶。3D Structural of an -Amylase-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物帮助剂。-淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的基础，如纺织工业上的退浆；酶法糖化制造葡萄糖、麦芽糖；酶法制造酒精、料酒等。例如，生产葡萄糖须要葡萄糖淀粉酶，但仅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶液，葡萄糖的生成速度特殊慢。此时，-淀粉酶的运用就成为必要条件。-淀粉酶的活性测定，在理论探讨和实际应用中具有重要的意义。通过本试验，学习一种测定-淀粉酶酶活力的方法，巩固并娴熟分光光度计的运用方法。2.2.试验原理试验原理 -淀粉酶能够将淀粉分子中的-1，4糖苷键随机切成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘的呈蓝色特性反应渐渐消逝，呈现棕红色，其颜色消逝的速度与酶活性有关，可以用来表示淀粉酶水解的程度，因而能购通过反应后溶液的吸光度值衡量酶的活力。3.3.试剂和溶液试剂和溶液3.1 3.1 原碘液原碘液 称取称取2.2g2.2g碘和碘和4.4g4.4g碘化钾完全碘化钾完全溶解后定容至溶解后定容至100ml100ml，储存于棕色瓶，储存于棕色瓶中（老师准备）。中（老师准备）。3.2 3.2 稀碘液稀碘液 吸取原碘液吸取原碘液2ml2ml，加，加20g20g碘化钾碘化钾用水溶解并定容至用水溶解并定容至500ml500ml。3.3 3.3 可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液 称取称取2.000g2.000g（精确到（精确到0.001g0.001g）可溶性淀粉于烧杯中，加适量蒸馏可溶性淀粉于烧杯中，加适量蒸馏水调成浆糊状物，边搅拌边加入沸水调成浆糊状物，边搅拌边加入沸水水90ml90ml，搅拌加热至完全透亮冷却，搅拌加热至完全透亮冷却后定容至后定容至100ml100ml，现配现用。，现配现用。3.4 3.4 磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH6.0pH6.0）4.52g 4.52g磷酸氢二钠（磷酸氢二钠（Na2HPO412H2ONa2HPO412H2O）和和0.8g0.8g柠檬酸（柠檬酸（C6H8O7H2OC6H8O7H2O），定容至），定容至100ml100ml。pHpH计校正后运用。计校正后运用。3.5 3.5 盐酸溶液（盐酸溶液（0.1M/L0.1M/L）100ml 100ml 4.4.仪器及器材仪器及器材4.1 仪器电子天平 2台恒温水浴锅 每组 1台分光光度计 每组 1台记时器 每组 1台3.2 3.2 器材（每组）器材（每组）15ml15ml大试管大试管1010支支5ml5ml移液管移液管1010支支1ml1ml移液管移液管5 5支支10ml10ml移液管移液管1010支支比色皿比色皿1 1套（套（4 4个）个）双蒸水双蒸水1 1瓶（瓶（50ml50ml）洗瓶洗瓶1 1个个玻璃平皿玻璃平皿1 1套套50ml50ml小广口瓶（棕色）小广口瓶（棕色）2 2个个50ml 50ml 容量瓶容量瓶 1 1个个100ml 100ml 容量瓶容量瓶 1 1个个500ml 500ml 试剂瓶试剂瓶2 2个个100ml 100ml 试剂瓶试剂瓶2 2个个250ml 250ml 三角瓶三角瓶2 2个个200ml200ml烧杯烧杯2 2个个500ml500ml烧杯烧杯1 1个个记号笔记号笔1 1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、研钵、纱布研钵、纱布5.5.试验方法试验方法 GB 8275-2009 GB 8275-2009法法 将淀粉作为底物，通过比色法测定碘显蓝反应色值的削减以测定-淀粉酶活力的方法。5.1 5.1 分析方法分析方法5.1.1 待测酶液的制备 精确称取1g酶粉，用少量pH6.0磷酸缓冲液充分溶解，将上清当心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至100ml，摇匀。四层纱布过滤，滤液放置于4冰箱待用。运用前 倍稀释。5.1.2 测定 A液：吸取20ml可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5ml，充分混匀后，置于60 恒温水浴中预热5minB液：将1ml稀释好的待测酶液加入A液，摇匀，立刻计时，精确反应5min C液：将0.5ml 0.1mol/L盐酸和5ml稀碘液加入试管中，摇匀待用立刻用移液器吸取1mlB液，加入预先盛有C液的试管中，摇匀同时设置空白组（以1ml磷酸缓冲液取代1ml稀释酶液）于660nm波长下，用10mm比色皿快速测定其吸光度值（A）依据吸光度表C1，查得所测酶液的酶活力5.1.3 计算酶活力 X=cX=cn n其中：X样品的酶活力，单位为u/g c测试酶液的酶活力，单位为u/g n样品的稀释倍数5.3 留意事项酶反应时间应精确计算。试剂加入按规定依次进行。6.6.试验报告试验报告 酶活活(u/g)1st2nd3rd平均平均值6.1 6.1 依据所得数据填写试验报告表依据所得数据填写试验报告表注：各测三次6.2 6.2 探讨探讨试验中遇见的问题及解决的试验中遇见的问题及解决的方法；方法；数据、结果的相关分析；数据、结果的相关分析；7.思索题1、淀粉酶活性测定原理是什么？2、测定酶活力，应留意什么问题？