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绪 论一 酶是生物催化剂酶是具有生物催化功能的生物大分子，按其化学组成的不同可以分为两类：蛋白类酶（P-酶）与核酸类酶（R-酶）。Ø 理解：1、酶是由生物细胞产生2、酶发挥催化功能不仅在细胞内，在细胞外亦可二酶学研究简史1897年，Buchner兄弟发现，用石英砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液能和酵母细胞一样进行酒精发酵。标志着酶学研究的开始。Ø 说明：酶分子不仅只是在细胞内起作用，而且在细胞外同样具有催化功能。这一发现开启了现代酶学，乃至现代生物化学的大门。三酶工程的现状：目前大规模利用和生产的商品酶还很少。第一章 酶学概论第一节 酶作为生物催化剂的显著特点一 酶作为生物催化剂的显著特点：高效、专一二 同工酶（概）：能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶。三共价修饰调节1 概念：通过其它的酶对其结构进行共价修饰，从而使其在活性形式和非活性形式之间相互转变。2 常见修饰类型：磷酸化与去磷酸化；腺苷酸化与脱腺苷酸化；尿苷酸化与脱尿苷酸化；泛素化；类泛素化3 例子：糖原磷酸化酶磷酸化形式有活性（葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖4 常见磷酸化部位：丝氨酸/苏氨酸，酪氨酸和组氨酸四酶活性调节方式Ø 要能判断所举酶的例子是什么类型调节1. 别构调节2. 激素调节：如乳糖合酶修饰亚基的水平是由激素控制的。妊娠时，修饰亚基在乳腺生成。分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。3. 共价修饰调节：如糖原磷酸化酶、磷酸化酶b激酶4限制性蛋白水解作用与酶活性控制。如酶原激活5抑制剂和激活剂的调节6反馈调节7金属离子和其它小分子化合物的调节8蛋白质剪接五反馈调节（概）：催化某物质生成的第一步反应的酶的活性，往往被其终端产物所抑制。这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。 A-J：代谢物实线箭头：酶促催化步骤虚线箭头：反馈抑制步骤代谢途径的第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。六蛋白质剪接（概）： 一个单一的前体蛋白通过剪接机制可以产生多种蛋 白质（酶）分子，从而具有不同的功能或活性。蛋白质剪接中，被切去的肽段称为内含肽(intein )，连接起来形成成熟蛋白质的肽段称为外显肽(extein)。蛋白质剪接的机制目前仍然是不清楚的。第二节 酶的组成、分类和命名一 酶的化学组成Ø 掌握酶蛋白和辅因子在酶促反应中的作用，一个决定了酶和底物结合的性质，即酶的专一性，还有决定了酶催化反应的类型。二国际系统分类法及编号1六大蛋白类酶 氧化还原类酶AH2+BA+BH2 转移酶AB+CA+BC 水解酶ABH2OAOH+BH 裂合酶ABA+B 异构酶 连接酶或合成酶A+B+ATPABADP+Pi（或ABAMP+PPi）在ATP供能下，将A和B结合在一起2 两个比较容易混淆的酶1）氧化磷酸化与光合磷酸化中，以跨膜质子动力势为动力推动ATP形成的酶是ATP合成酶还是ATP合酶？催化的反应：ADP+PiATP 裂合酶的逆向反应 合成酶：synthetase; 合酶：synthase Ø 答：应该叫做合酶2）DNA (RNA)聚合酶属于六大类酶中的什么类型？ 催化的反应：dATP+DNA DNA-dAMP+PPi dATP = dAMP+PPiØ 通式：AB+CAC+B 所以属于转移酶Ø 要记住各大类酶的编号，作用特点，会判断反应类型第三节 酶的活力测定一酶活力(概)：在一定条件下，酶所催化的化学反应速度，它可以用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示。二酶活力测定方法的注意事项：1底物及底物浓度的选择 a.根据其专一性选择底物；b.一般采用高底物浓度测定法(10-20 Km)，因为高底物浓度时反应速度无限接近于最大速度，10-20 Km，接近又不浪费Ø 注意：不是所有酶测定酶活是都采用高底物浓度测定法，有底物抑制作用的酶（即在高底物浓度条件下活性降低的酶不能用这种方法）三比活力（概）：在特定条件下，每毫克(mg)酶蛋白所具有的酶活力单位数，即：酶比活力=酶活力（单位）/mg蛋白。它是酶纯度的一个指标。 四酶的转换数（概）：又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔（或微摩尔）酶每分钟催化底物转变为产物的摩尔（或微摩尔）数，是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示，单位为min-1。五. 酶的催化周期（概）：是指酶进行一次催化所需的时间，单位为毫秒或微秒。在数值上等于酶的转换数的倒数。第四节 酶的结构与功能一酶分子中的氨基酸残基对酶促反应的不同贡献Ø 四种残基，列出作用后要能判断是哪一种类型二酶的活性部位（中心）Ø 掌握概念和结构组成的两部分1概念：酶分子中，显示酶的催化活性的特殊部位称为活性部位。 2结构组成： *底物结合部位与催化部位并不是绝对的，活性中心的某些基团同时兼有这两种功能。 三酶活性基团的鉴定： Ø 掌握两种物理方法的特点 Ø 掌握酶分子三种失活所对应的集团四 酶的结构改变对其催化功能的影响Ø 掌握：破坏了哪一种集团以后会引起怎样的结果（一）酶的一级结构改变对其催化功能的影响1主链断裂 切除非贡献残基几乎不影响酶活（但不能过长） 切除接触残基、辅助残基和结构残基酶活性丧失 酶原激活显示出催化活性；实质：活性中心的形成和暴露。2二硫键断裂 影响空间构象酶活性丧失 不影响空间构象不影响酶活性（二）酶的二、三级结构改变对其催化功能的影响酶活丧失（三）酶的四级结构破坏对其催化功能的影响 第五节 酶的作用机制一 酶和底物结合的作用力Ø 注意：它们都是非共价结合离子键：底物上的一个带电荷的基团与酶分子的另一种带相反电荷基团的作用。本质：静电吸引力。氢 键：底物与酶蛋白的两个电负性较大的原子，如N, O共同享有氢原子而形成的结合力。 范德华力：底物与酶蛋白的两个原子在相距0.3-0.4 nm时存在的一种非专一性的吸引力，弱，专一性小。当酶与底物处于立体互补时，大量的范德华键的形成就导致了酶的专一性的出现。二 酶催化反应降低活化能的来源1 酶分子中的催化功能基团（特定的氨基酸残基侧链、金属离子和辅酶）与底物形成瞬时的共价键，并激活底物参与化学反应，甚至有时底物分子上的某些基团还可以暂时性的转移到酶分子的功能基上。这些可以提供另外的低能途径来降低反应的活化能。（次要）2 酶促反应降低的活化能主要来源于酶与底物间的非共价相互作用（结合能）。ES复合物中每一个弱的相互作用的形成，都伴随有少量的能量释放。由于这部分结合能的释放，部分的抵消了非酶反应时所需要吸收的能量，因此反应的活化能水平大大降低。而这种弱的相互作用在酶催化反应的过渡态时更为有效。三一个所谓进化完全的酶必须具备与基态底物弱结合而与过渡态底物强结合的性质。四能障1 概念：（大概理解一下，这个不准确）S与P之间还存在有能障（energy barrier)，这个能障用于反应过程中基团的重新排列、不稳定的瞬时电荷的形成、化学键的重排，以及其它反应所要求的转变步骤等2 能障的意义：如果没有能障，细胞内复杂的大分子将会自发地回复到其较为简单的分子形式，细胞所具有的高度复杂有序的结构以及代谢过程都将不复存在。 酶分子正是通过长期进化而来的用于选择性降低细胞生存所必须反应的活化能的。五趋近与定向效应（概）：由于酶分子具有活性中心，活性中心上的基团可以与底物相互接近，并使底物集团与酶活性中心的催化集团按照正确的方位几何定向，有利于种间产物的形成和催化反应的进行。六构象变化效应（概）：当酶分子与底物分子互相接近时，由于两者的相互作用，酶分子和底物分子都会发生构象变化，从而更有利于酶与底物的结合和反应，使反应速度大大提高。七多元催化（概）：由于酶和底物的结合，在酶促催化过程中通常可以几个基元反应配合在一起共同作用，从而使酶反应加速。八酸碱催化1 概念：酶和底物分子之间通过质子(H+)传递作用，即酸和碱的相互转变，从而有利于过渡态的形成和稳定，使得反应所需的活化能降低，使反应加速进行2 影响因素： a. 酸碱强度 b. 供出或接受质子的速度Ø 为什么组氨酸含量少，但却很重要，主要从上面两个角度进行探讨，它在这两个方面有什么优势九共价催化概念：在酶的催化作用中，底物和酶形成一个反应活性很高的共价中间产物，这可以通过提供另外的低能途径而降低反应所需的活化能，使反应加速进行。 分类Ø 以下两种催化，到底是酶上还是底物上有亲电集团 酶 底物亲核催化 亲核基团（富电子） 攻 亲电基团（缺电子）亲电催化 亲电基团（缺电子） 击 亲核基团（富电子）十微环境效应（概）：酶的活性中心上的催化基团处于一种特殊的疏水反应环境，使得酶的催化基团被低介电环境所包围，并可以排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，从而加速酶反应。这种作用称为微环境效应。 十一.酶活性部位的柔性（我国科学家邹承鲁先生首次提出）1 概念：天然状态的酶具有完整的三维空间结构，其中活性部位跟其它结构部位相比，具有较大的柔性，也就是说酶活性部位基团的运动性较大。因此，当低浓度的变性剂作用时，酶分子整体刚性部分构象保持完整，而较柔性的活性部位的局部结构已发生明显变化，如活性基团的相互靠近和立体取向受到破坏，导致酶活性的丧失。2 意义：酶活性部位的柔性是酶充分表现其活性所必需的满足底物结合诱导的构象调整（诱导契合），使得活性部位的活性基团形成一定的空间取向，以保持一个适应催化反应的空间微环境；残基侧链活性基团的运动更加有利于催化的高效性； 很多酶的催化效率和底物专一性受到其它因素的调节，这就要求酶的活性部位保持一定的柔性，使其局部环境受到调节因素的影响后能发生细微的构象变化，从而调节酶的活性和底物专一性。3 柔性与刚性之间的辩证关系酶的柔性和刚性是局部的，也是相对的对于局部柔性部位的维持必须要有刚性部分来支撑；酶分子既要保持相对稳定的整体结构，又必须要有相对柔性的微环境状态。正是这种刚柔相济的独特酶分子结构，构成了酶的催化作用高效性和可调节性的结构基础。十二.辅因子在酶促反应中的作用之金属离子Ø 不会出问答题，但5个作用一定要理解使酶稳定于催化活性构象；金属离子本身可得到电子或失去电子而发生价态的变化，因而可以作为亲核剂或亲电剂；金属离子还可以通过接受或供出电子，激活亲电剂或 亲核剂；金属离子带正电荷，因此可以掩蔽亲核剂，以防止不需要的副反应发生；通过配位键，将酶和底物结合在一起，使底物趋近酶分子，并促使酶的活性中心与底物之间的反应基团具有正确的空间定向。第六节 酶催化反应动力学一根据中间产物学说推导米氏方程根据中间产物学说，单底物单产物酶促反应可以表示为：由于E+SES的速度极小，尤其是在反应处于初始阶段时，故k-2可忽略不计。因而酶催化反应方程可以简化为；根据稳态学说，有：即：由于E0=E+ES，因此上式可以表示为：则：KmES=E0S-ESS因此由于v0=k2ES，vmaxk2E0，所以一般反应体系中，底物浓度远大于酶的浓度，故酶底物络合物ES的形成对底物浓度而言可以忽略不计，故可以用S0代替S，于是上式可以写为：二米氏方程的讨论1 Km的意义：达到1/2最大反应速率时的底物浓度2 Km是酶的特征常数，它可以表示酶同底物的亲和力 Km大，亲和力小；Km小，亲和力大3 Km是酶的特征常数，它是针对特定的反应与特定的反应条件而言的。不同的酶，具不同的Km值；同一种酶作用于不同的底物，具有不同的Km值；同一种酶，催化同一种底物反应，但反应条件不同，也具有不同的Km值。一般而言，Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。4 判断酶的最适底物：Km最小，也叫天然底物5计算一定速度下的底物浓度或一定底物浓度下的反应速度。（即记熟米氏方程）6了解酶的底物浓度在体内具有的浓度水平：（即在Km值附近）一般说来，作为酶的最适底物，其在体内的浓度水平应接近于它的Km值。如S体内<<Km，则v<<vmax,说明大部分的酶在体内是不起作用的，处于一种浪费的状态；反之，如S体内>>Km， vvmax,这种底物浓度就失去其生理意义，也不符合实际情况。 7 区分Km与Km/Ø 不能简单的把Km看作没有抑制剂时的米氏常数，而把Km/看作有抑制剂时的米氏常数8 Kcat/Km可用于a.比较不同的酶或同一种酶催化不同底物反应的催化效 率，Kcat/Km值越大，酶的催化效率越高。b.检验反应是否达到稳态或平衡态快速反应研究证明酶和底物结合的速度常数为109 s-1·mol-1·L数量级，如果Kcat/Km为同样的数量级就可以假定为稳态。9米氏方程中Km及vmax的求法双倒数方程Ø 要注意底物浓度的选择，不能过大也不能过小，要在Km附近，为什么要在Km附近？结合米氏方程来讨论三 抑制作用1 概念：酶蛋白分子上的必需基团受化学物质的影响而发生化学性质的变化，并由此引起酶活力的降低或丧失。这种现象称为抑制作用。能引起抑制作用的物质称为酶的抑制剂，包括药物、毒物、抗生素、抗代谢物，以及大分子蛋白质，小分子化合物 （CO, N3-,CN-等非金属离子，重金属离子）。2 如何用动力学方法区别可逆与不可逆抑制具体解释见讲义P21一定量的抑制剂与酶混合，预保温一定时间后，取不同量的混合液测定其在固定体积的反应体系中的初速度。 可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（一）1， 无抑制剂；2， 有不可逆抑制剂；3， 3，有可逆抑制剂。 固定反应体系的体积，先在其中加入一定量的抑制剂，再加入不同浓度的酶，测定酶活。可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（二）1， 无抑制剂；2， 有不可逆抑制剂；3， 3，有可逆抑制剂。 3 不可逆抑制剂Ø 以下两种Ks型和Kcat型它们的特点，为什么叫做Ks型？它指的是酶分子和抑制剂还是有一种亲和性；而Kcat型，就是结合上去之后，有一个催化反应，把它的潜伏反应集团活化。Ks型不可逆抑制剂 结构特征： a.具有和底物相类似的结构，可以与相应的酶的底物结合部位结合； b.带有一活泼的化学基团，可以和酶分子中的必需基团起反应，对之进行化学修饰，从而抑制酶的活性。 作用特点： a.抑制作用是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标 记，故又称亲和标记试剂。 b.该种试剂一般只对底物结构和其相似的酶有抑制作用，故有一定的专一性。c.该种试剂的专一性有一定的限度，因其活泼基团还可以修饰酶分子其它部位的同一类基团。其选择性取决于抑制剂与活性中心必需基团形成非共价络合物的解离常数以及非活性中心同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值。如果相差3个 数量级以上，就可以忽略副反应。 应用：研究酶活性中心的结构。 在抑制剂上引入某种具有特殊光学性质的基团，而这 些基团又可以随着酶分子局部微环境的不同而改变，这种基团就可以作为“报告”基团报告活性部位微环境的性质。Kcat型不可逆抑制剂 结构特征：具有一潜伏反应基团。 作用特点：a.当酶对抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被反应而活化，与活性中心发生共价结合，并使得结合物停留在这种状态，不能再分解生成产物，酶因而致“死”。 b.抑制作用的效率及专一性不但与Ks有关，更重要的是取决于Kcat。Kcat愈大，Is生成的速度愈快，抑制作用也愈强。应用：医药及生物防治。 将酶作为靶子，通过设计特定的化合物抑制其活性或使其失活。4 可逆抑制Ø 每种可逆抑制作用的特点。竞争性抑制：不会有三元络合物形成；非竞争性抑制：有三元复合物形成；反竞争性抑制：抑制剂只可能与结合有底物的酶分子进行结合Ø 各种抑制的例子。竞争性抑制：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制；非竞争性抑制：金属离子与巯基结合以后，再来改变活性中心的构象 5 混合型抑制Ø 它是一个一般的情况，之前三种都是特殊情况。四 双底物双产物反应动力学分类Ø 掌握下面三个机制的特点，到底有没有三元络合物的形成，乒乓机制没有，前面两个有；序列有序和序列随机到底是怎样的方式反应通式：E+A+BE+P+Q（1）反应过程中形成三元络合物E+A+BEABEPQE+P+Qa序列有序机制：两种底物按一定的顺序与酶结合，只有当第一个底物与酶结合后，第二个底物才结合上去，产物P和Q的释放也按照一定顺序进行，也即： b序列随机机制：两种底物不按一定的顺序与酶结合，产物也为随机释放，也即：（2）反应过程中不形成三元络合物乒乓机制酶首先与一个底物结合，释放一个产物，而后再与另 一个底物结合，再释放出产物，即底物和产物交替地与酶结合或从酶释放，反应过程中无三元络合物形成。 第七节 别构酶及其反应动力学 一别构酶（概）：由多个亚基组成的，分子中除结合底物并催化底物转化的活性部位外，还有结合别构效应物（别构配体）的部位。这两个部位位于不同亚基上，也可能位于同一亚基的不同部位。别构配体与酶结合后，可改变酶分子亚基间的结合状态（疏松或紧密），从而影响酶对底物的结合及酶的催化能力（正或负）。二别构酶的结构特点之一：有时因物理或者化学的变化（如加热、冷冻、尿素等处理），酶会失去对效应物的敏感性，但是催化活性并未失去。这种脱敏的酶表现出正常的双曲线动力学特征。Ø 脱敏感酶：别构酶由于构象的改变，对于效应物不在敏感，但本身的催化活性并未失去，正常的双曲线特征是完整的保留着的三别构效应类型的判断1协同指数：Rs反应速度分别达到最大反应速度90%和10%的时候所对应的底物浓度的比例。Rs>81为负协同效应；Rs <81为正协同效应2Hill系数四别构效应的动力学模型Ø 掌握两个模型的特点，它们到底强调的是什么东西，用于解释别构效应类型的时候，解释别构效应反应特点的时候，有怎样的适用性。前提： 1别构酶的别构效应是由于寡聚酶亚基间的协同作用产生的； 2每个亚基都有两种不同的构象状态 T状态(Tight state)：紧密态，不利于结合底物或调节物。 R状态(Relaxation state)：松弛态，有利于结合底物或调节物。（一） MWC模型（齐变模型，同构模型，对称模型）1 主要观点：（1） 酶分子中的亚基只可能以一种相同的构象存在，也即不存在RT杂合物，并且T状态与R状态中亚基的排列是对称的；（2） 无配体的时候，T状态与R状态之间存在着平衡。一当有配体存在时，平衡被破坏。2特点：可以很容易地解释正负调节物的作用，但不适用于负协同效应。（二）KNF模型（序变模型） 1 主要观点：（1） 酶分子各个亚基的构象由R状态转变到T状态不是同时进行的，也即RT杂合物是存在的（2） 由T状态转变到R状态是由配基的结合而诱导产生的（3） 配基在KNF模型中可以是正协同效应的，也可以是负协同效应，这取决于配基结合以后对其它亚基的影响2特点：该模型认为酶分子有许多中间构象状态存在，因此用来解释别构酶的酶活性调节作用要比MWC模型更好一些，适用于大多数酶。特别是在描述异促效应时，一般认为要比MWC模型更好一些。 无论是MWC模型，还是KNF模型，都只是考虑了最 简单的情况，而忽略了其它情况。因此对于试验结果的解释，始终存在一定的局限性。五别构酶的生理调节功能Ø 具体例子不用管，但根据例子所引述的或总结的普遍性的原则要知道，正负协同效应分别有什么功能，别构酶在整个的代谢链条中处于什么位置，因此就决定了它有什么样的特点1 正协同效应正协同效应可以使得反应底物浓度在一个很窄的范围内即可快速大量地合成产物，并能调节参与几个不同代谢途径的底物在各个代谢途径中得到合理的分配。2负协同效应负协同效应使得酶促反应速度对低的配体浓度相对不敏感，从而得以保证代谢中某条重要途径在底物浓度较低时能够较为稳定地进行下去。总之，别构调节是快速影响酶活力的一种重要方式，受到别构调节的酶通常处于代谢途径的起始点或者分叉点，也可能处于代谢途径中部的关键位点或者限速位点上，在体内的代谢调节中有很重要的作用。第八节 pH和温度对酶催化反应速度的影响一最适pH： *最适pH并非酶的特征物理常数，它只能作为一个实验参数。二pH对酶稳定性的影响： 强酸强碱：不可逆变性失活； 非强酸强碱：有时引起可逆变性失活，有时不可逆变性失活。Ø 到底是可逆还是不可逆，如何判断？保温，最适PH测定，恢复的为可逆，不恢复的为不可逆三最适温度：酶的最适温度也不是酶的特征常数。四临界失活温度（概）：酶在一小时内损失一半活力时的温度，可用于比较不同酶的稳定性。Ø 当它用于比较酶稳定性时，该温度升高说明稳定性增强还是减弱第九节 核酶 一 核酶的典型性例子1 原生动物四膜虫26SrRNA加工成熟（并不是一个真正意义上的酶）2 第一个完全意义上的核酶是RNA酶P3 核糖体的23S肽酰转移酶也是一个核酶二自我剪接机制Ø 核酶自我剪接机制所运用的是转磷酸酯反应，即磷酸二酯键断裂后重新形成三自我剪切机制酶的结构特点一级结构上，具特定的保守序列（酶的活性部位）和剪切点序列（底物）。高级结构：具独特的空间结构和构象。四脱氧核酶Ø 脱氧核酶并非催化能力本身就一定要低于蛋白类酶及核酶，即在催化潜能上并不能作出结论脱氧核酶一定低于核酶或蛋白类酶Ø 问题：通过延长1023核酶的结合臂的长度，将会对该酶催化底物反应的Km和Kcat产生什么影响？ 五现阶段, 蛋白类酶仍然是催化分子的绝对主力（论述）(一)自然界经过亿万年的进化后所选择的催化分子所具有 的特点： 1 组成的元件比较丰富，有利于针对不同的反应形成特定的复杂空间结构；2 具多种活性基团;3 能够遗传和变异。二）目前已经获得的核酶/脱氧核酶与蛋白类酶在催化类型和活力上都相差甚远1.从蛋白质和核酸本身的化学组成来看，蛋白质比核酸具有更大的催化潜能。1）蛋白质分子中有许多RNA/DNA中所没有的共价催化基团以及酸碱催化基团；2）蛋白质分子中还可以形成非极性的活性中心空穴，在这里催化基团被低介电环境所包围。这样底物分子和酶的催化基团之间氢键及静电相互作用被增强，有助于加速酶促反应；3）蛋白质骨架的刚性比核酸强，可以折叠成更加紧密稳定的三级结构，有助于形成复杂而稳定的催化构象；4）蛋白质的组成元件有20种，这样蛋白质就比核酸的组合多样性多出许多数量级。从中得到可以催化某一反应的顺序的可能性大大增加，同时获得的有催化能力的结构也更为合理。 （二）目前核酶/脱氧核酶的许多结构和功能还远远没有被开发出来；（三）目前的体外选择无论在空间还是时间上都很有限。Ø 原因，本身蛋白类酶从催化的可能性上，由于它结构上的特点，它本身就要比核酶和脱氧核酶具有更大的潜能；由于目前对核酶和脱氧核酶的研究还不够深入，很多的结构还没有被开发出来。第十节 抗体酶一抗体酶（概）：又称催化性抗体，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论和技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化功能巧妙结合的产物。二抗体酶目前的特点：抗体酶的催化效率普遍要低于蛋白类酶，主要原因是因为缺乏结构上的柔韧性第二章蛋白质的稳定性与稳定化第一节 蛋白质的稳定性一蛋白质的稳定性（概）：蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。二蛋白质稳定性的因素之疏水相互作用1 疏水相互作用形成的驱动因素a.蛋白质分子中的疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫相互接近。当疏水基团接近到等于范德华距离时，相互间将有弱的范德华引力；b.蛋白质溶液的熵增（主要因素，主要掌握）当疏水化合物或基团进入到水中时，它周围的水分子将排列成刚性的结构，即所谓笼形结构。使得熵值减小。但是，由于疏水相互作用，排列有序的笼形结构将被破坏，水分子被排入自由水中，这样水的混乱度增加，即熵增加。因此疏水相互作用是熵驱动的自发过程。2 疏水相互作用的特点在生理温度范围内随温度升高而加强。但超过一定温度（5060，因侧链而异）后，又要减弱三蛋白质的变性过程：两步过程第一步：可逆伸展，此步完全可逆，去除变性因素及恢复第二步：接下来，如果变性因素不去除，则可导致酶不可逆变性第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理五 聚合作用：很多条件下，蛋白质变性失活的主要原因聚合过程：NUAA31可逆伸展：蛋白质可逆变性，原来包埋在蛋白质分子内部的疏水氨基酸残基暴露；2三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大限度地减少疏水氨基酸残基不利的裸露；3如果蛋白质分子含有半胱氨酸残基或胱氨酸残基，则会发生分子间二硫交换反应。 Ø 特点：该过程并不一定是不可逆的，当去除变性的作用因素时，通过还原和再氧化再生天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。Ø 有机溶剂到底是怎样破坏蛋白质稳定性的？现在的观点：首先破坏氢键，氢键破坏以后蛋白质就伸展，蛋白质就有一种相互聚集的趋势。它先靠着疏水相互作用，把疏水集团相互接近，接近以后，如果有二硫键的话，就会发生二硫交换反应，则就会把它们紧紧的拉在一起，而这种结合又是非正常情况下的结合，所以蛋白质就变性了。即整个过程分为三步：可逆伸展彼此缔合二硫交换反应 第三节 蛋白质的稳定化一固定化Ø 固定化是提高蛋白质和酶稳定性的一个及其重要的方法，因此对于为什么固定化以后可以增加酶分子的稳定性必须掌握分为以下三点：1空间障碍：使得其它大分子难于与酶接近和作用，可以防止蛋白水解酶和蛋白酶抑制剂的作用。同时，还可以防止化学失活；2分配或扩散限制：酶被固定化后，尤其是用包埋法固定化时，底物必须先扩散到载体表面，然后才能进入到内部与酶作用。此时，由于扩散限制使得反应速度对酶浓度的依赖性减弱，而对底物的获得依赖性增强，使得酶的“稳定化”程度增加；3抑制酶的自降解：固定化可以使得酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。 二非共价修饰1反向胶束：是酶和表面活性剂在与水不相混溶的溶剂中所得到的一种酶分子形式。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。Ø 反相胶束是如何形成的？正常水溶液中，是亲水的头部向外而疏水的尾巴向里面，反向胶束恰恰相反，是疏水的尾巴朝外亲水的头部在里面，这是由于周围环境的不一样，是在有机相里面形成，而不是在水相中形成第三章 酶的发酵生产第一节 概述一酶的发酵生产（概）：又称为酶的生物合成法生产，是指经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要的酶的过程。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。二酶的发酵生产类型Ø 记住四种类型每一种的特点（一）固体培养发酵（传统方法，现在用的不太多了）以麸皮、米糠等为主要原料，加入其它必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经灭菌、冷却后，接入产酶菌株，在一定的条件下进行发酵。我国传统的各种酒曲、酱油曲等都采用这种方式生产。优点：设备简单，操作方便，麸曲中酶浓度较高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶。缺点：劳动强度较大，原料利用率较底，生产周期较长，对发酵过程很难调节控制（二）液体深层发酵：将液体培养基置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。它是目前酶发酵生产的主要方式。特点： 适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵； 易于人为控制； 机械化程度高，酶产品质量较好，酶产率及产品回收率较高。 （三）固定化细胞发酵（70年代后期）固定化细胞（概）：固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。优点：固定化细胞的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提高生产能力；发酵稳定性好，固定化细胞可以反复使用或连续使用较长的时间，易于连续化，自动化生产；细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，大大提高设备利用率；发酵液中含细胞较少，利于产品分离纯化，提高产品质量。缺点：只适用于胞外酶的生产；技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器，且许多技术问题都有待研究解决。（四）固定化原生质体发酵（80年代中期）Ø 由于解除了细胞壁屏障，所以对于生产胞内酶有独特的优势优点：解除了细胞壁这一扩散障碍，使胞内酶不断分泌到胞外，或使原来存在于质膜外细胞间质中的酶游离到发酵液中；固定化原生质体有较好的稳定性，可反复或连续使用较长的时间。 缺点：固定化原生质体的制备较复杂，发酵培养基中需要维持较高的渗透压，且还要防止细胞壁的再生。第二节 发酵工艺条件及控制一产酶细胞的保藏：（低温） 4，固体培养物或液体培养物（一般半年）; -20，加入抗冻剂如甘油或二甲亚砜的液体培养物（一般两年）; -70，加入抗冻剂如甘油或二甲亚砜的液体培养物（可长期保存）。 注意：Ø 有细胞壁的细胞可以速冻，且取出后可缓慢升温Ø 而无细胞壁的细胞只能逐级冻存，先4，再到-20，再到-70，且从低温条件下取出后应迅速升温至37，即迅速在37水浴中升温。Ø 低温保存的细胞，应避免频繁冻融。 二碳源对原核生物酶生物合成的三种调节作用Ø 概念不要求掌握，每种调节作用中都有例子，给出例子要能够判断到底是什么作用类型a.诱导作用：诱导物一般是酶催化作用的底物或底物类似物，有些酶的诱导物则是该酶的催化反应产物；Example:-半乳糖苷酶的作用底物乳糖及其类似物异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导-半乳糖苷酶的合成，纤维二糖作为纤维素酶的催化反应产物可诱导纤维素酶的生物合成。 b.分解代谢物阻遏作用：某些物质（主要是指容易利用的碳源）经过分解代谢产生的分解代谢物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象；Example:葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成。c.反馈阻遏作用：又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏的现象。*应尽量选用对所需的酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源；三溶氧速率标准溶氧速率不宜过高，这是因为：1. 浪费；2. 高溶氧速率会抑制某些酶，如青霉素酰化酶等的生成;3. 为获得高溶氧速率而采用的大量通气或快速搅拌等措施会使某些细胞受到损伤。 Ø 本身在发酵的时候，氧的利用率是比较高的，但水中的溶解氧并不很多，因此要想方设法的增加溶解氧的供给，但溶氧速率又不能过高，溶氧速率的标准是：溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可，耗氧速率=细胞呼吸强度×细胞浓度。第三节 产酶动力学六 酶生物合成的模式Ø 掌握四种模式的特点，例如，同步合成型：细胞一生长就有酶合成，细胞生长停止以后，酶的合成也就停止了。到时候会把图画出来，判断是何种类型，或者描述酶合成时的特点来判断类型 酶生物合成的模式 细胞浓度，酶浓度I同步合成型,II延续合成型,III中期合成型,IV滞后合成型 1同步合成型 特点：酶的生物合成可被诱导，但不 受阻遏。而且当除去诱导物或细胞进 入平衡期以后，酶的合成立即停止。该酶所对应的mRNA是很不稳定的。2延续合成型： 特点：酶的生物合成可被诱导，但不受阻遏。该酶的mRNA相当稳定。3中期合成型： 特点：酶的生物合成受反馈阻遏。该 酶的mRNA是不稳定的。4滞后合成型： 特点：对数生长期不合成，可能是 由于受到分解代谢物阻遏作用的影 响，当阻遏消除以后，酶才开始大 量合成。该酶的mRNA稳定性高。 Ø 延续合成型是酶的工业生产中最理想的合成模式（掌握原因） 属于这一类型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生长一段较长的时间。第五节 动植物细胞发酵产酶一动植物细胞与微生物的主要特性差异 Ø 动植物细胞与微生物细胞相比较而言最重要的两个特点：动物和植物细胞的体积比微生物细胞至少大1000倍，而且动物细胞没有细胞壁，因此对于搅拌等剪切力特别敏感，很容易由于搅拌的原因造成细胞破裂植物细胞和动物细胞本身的代谢速率和生长速率都要比微生物细胞低，这就使得它们的倍增时间比较长，这也就使得它们的发酵周期比微生物细胞长很多第六节 酶制剂的工业制备法七 发酵液的预处理的目的（四点都记）：1改变悬浮液中固体离子的物理特性，如提高硬度，加大颗粒尺寸，改变其表面类型等；2使某些可溶的胶粘物质变成不可溶；3改变液体的某些物理性质，如降低粘度和密度。总之，预处理的目的是使发酵液中的酶易于通过分离和过滤与发酵液中的其它成分分开。方法：一般是加絮凝剂或凝固剂。如，聚丙烯酰胺，聚谷氨酸，右旋糖酐，一些廉价的无机盐等。4产胞内酶的细胞还需对细胞进行处理，以使胞内内酶最大限度地释放。方法：细胞自溶，增加壁膜透性或使细胞破碎。也可使用专用设备，如超声波振荡器、高压喷挤设备、匀浆装置及振动球磨。Ø 共同的是前面的三点，主要是使发酵液中的酶与周围粘稠的液相相分开，便于分离纯化，而且产胞内酶的还必须经过细胞的破碎的过程，使胞内酶最大限度的释放第四章 酶的分离工程第一节 酶分离纯化的一般原则一评价分离提纯方法的指标 总活力的回收率，反映了提纯过程酶活力的损失情况； 比活力提高的倍数，反映了纯化方法的效率。Ø 这两个指标分别反映了什么情况，且要记住这两者不可兼得。第二节 细胞的破碎及酶的提取一酶液的提取1