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过氧化氢酶米氏常数 篇一：过氧化氢酶动力学常数测定 实验工程二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：章恒炯 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据 1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：据 （二）结果计算 1换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2） 2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min） (A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=5FW=5.lt=10min 二、动力学常数的测定 （一）原始数据 （二）求出各管反响前的底物浓度S0和反响速度V0 （三）以1/V0对1/S0作图（用excel作图） 1/s 1/v （四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min） Km11? vvSv如（三）中图maxmax y829 x=0时 y=1/Vmax y=0时 x=-1/Km 第四部分：课后研讨题 1.总结本实验操作过程的本卷须知。 1酶的提取和存放一般在0-4下进展。 2每个三角瓶内的酶促反响时间要准确操纵在5min。 3各反响瓶的滴定终点微红色为同一标准。 4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴参加。2.阻碍过氧化氢酶活力测定的要素有哪些? 1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。 2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。 3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关? R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3+OH) R(Fe3+OH)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2 4.在反响速度的测定中，参加硫酸有哪些作用？ 终止反响,为下一步的滴定提供酸的环境。 5.米氏方程中的Km有何实际应用？ 米氏常数是酶促反响速度n为最大酶促反响速度值一半时的底物浓度。可用于推断反响级数；推断是否为不同种酶；推断酶的最适底物；确定酶活性测试时所需底物的浓度。 6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？ 当=Vmax/2时，Km=S。Km值是酶促反响速度为最大速度一半时的底物浓度。 Km值对某一特定酶来说是个常数。一半按照酶的Km值来推断这些酶是否是完全一样的酶，或是催化同一反响的一类酶。 Km值越大，酶与底物亲和力越小；Km值越小，酶与底物亲和力越大。 7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进展？ 进程曲线是在酶反响的最适条件下采纳每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反响时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反响时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反响速度下降。反响速度随反响时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反响加强等缘故所致。 8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反响溶液吸光度(A240)随反响时间而降低。按照测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅材料一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。 实验概要 本实验用紫外吸收法测定了过氧化氢酶的活性。 主要试剂 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 主要设备 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴。 实验步骤 1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，参加23ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5下保存备用。 2. 测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表顺序参加试剂。 表 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表25预热后,逐管参加0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。篇二：测定过氧化氢酶Km 实验一 过氧化氢酶Km的测定 【原理】 本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化以下反响： ?2H2O+O2 2H2O2?过氧化氢酶 H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。 2KMnO45H2O23H2SO4 ? 2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反响前后H2O2的浓度差即为反响速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。 【试剂】 10.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100105烘12h。冷却后， 准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，参加浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可储存数周。 2约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用外表皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。 30.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70水浴中用KMnO4储存液滴定至微红色，按照滴定结果算出KMnO4储存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。 4约0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。 50.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。 【操作步骤】 l血液稀释 汲取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。 3反响速度的测定：取单调干净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。 参加物(ml) H2O2(约0.08mol/L) 蒸馏水 将各瓶置37水浴预热5min，依次参加1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加 边摇，接着保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反响立即终止。 最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。 【计算】 1反响瓶中H2O2浓度(mol/L)? H2O2 mol浓度?参加H2O2ml数 4 ? H2O2 mmol数 4 （式中：4为反响液量4ml） 2反响速度的计算：以反响消耗的H2O2 mmol数表示。 反响速度=参加的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数 即：H2O2 mol浓度×参加的毫升数KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反响中mol换算系数） 3求Km值： 下面援用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。 己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下： 计算程序 加人H2O2数 加人H2O2mmol=×0.08 底物浓度S=÷4 酶作用后，KMnO4滴定ml 1 0.50 0.04 0. 剩余H2O2mmol=××5/2 0.0135 反响速度V=一S/V=÷ 0.377 0.465 0.536 0 按前述方法作图求得Km0.032mol/L。 【考虑题】 lKm值的意义是什么？ 2测酶Km值的实验中，需要特别留意哪些操作？篇三：酶工程实验(2015.3) 实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定 一、 目的 理解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 二、 实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性 环境中滴定，按照反响前后H2O2的浓度差可求出反响速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/1/S作图求Km 三、 实验器材 1. 锥形瓶100150ml（×6）。 2. 吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。 3. 温度计（0100）。 4. 微量滴定管5ml（×1）。 5. 容量瓶1000ml（×1）。 四、 实验试剂 1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。 2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。 3、0.02mol/L KMnO4 ：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。 4、0.004mol/L KMnO4 ：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml04mol/L即可。 5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml参加1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。 6、25% H2SO4 五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序参加试剂： 表一 过氧化氢酶米氏常数的测定 先加好O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反响时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反响，充分混匀。用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、计算 分别求出各瓶的底物浓度S和反响速度v。 S=c1V1/10 式中S：底物物质的量浓度（mol/L）；c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2体积（ml）； 10：反响的总体积（ml）； ：反响速度（m mol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4体积（ml）； 以1/对1/S作图求出Km。 实验二 酶促反响中初速度时间范围测定 一、实验目的 1.理解酶促反响中初速度时间范围测定的根本原理； 2.掌握酶促反响中初速度时间范围的测定方法。 二、实验原理 酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。 酸性磷酸酯酶能专注性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。 利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。 酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反响的最适条件下，每分钟生成1mol产物所需的酶量。 要进展酶活力测定，首先要确定酶反响时间。而酶的反响时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制造来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制造是指在酶反响的最适条件下，采纳每隔一定时间测定产物生成量，以酶反响时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反响时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反响速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。 三、实 （1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取） （2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.60.7之间。 准确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。 （4）0.3mol/LNaOH溶液 2器材 恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。 四、操作步骤液的制备 称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在2530°C温箱中培养57d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。应H终止反响。冷却后以0号管作空白（0号管参加1.0mL NPP后保温25min，然后参加3.0mL 0.3mol/L NaOH，再参加1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。 以反响时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反响初速度的时间范围。 表1.1 制造酶促反响进程曲线时各物质参加量 五、实验 绘出酶促反响进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反响初速度的时间范围。