泸州市中考满分作文-HBV m.doc
HBV-DNA保守区班级：09生物技术 学号： 姓名；陈雅静 【摘要】 为制备HBV-DNA探针做准备，首先对人乙型肝炎病毒进行S基因的保守区分析，获得其保守区核苷酸序列.接下来可用限制性内切酶不完全水解或者PCR特异性扩增获得该基因的保守区片段。In order to prepare HBV-DNA probes, we analyze the heron hepatitis B virus S gene to get domain sequence at first . Then we make use of restriction enzymes or PCR specificity amplification to get domain segment of S gene. 【关键词】 HBV-DNA,保守区，探针，乙肝诊断，PCR特异性扩增，限制性内切酶酶切，生物信息学前言乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，简称HBV）引起的一种世界性疾病。受HBV慢性感染的人群患原发性肝癌（hepatocallular carcinoma· Hcc）的相对危险性至少增加100倍。因此加强对乙肝诊断和治疗的研究，建立和改进简便、快速、灵敏、特异的早期诊断技术和指示乙肝愈合与转阴情况，以及评估慢性携带者的检验方法，仍是我国医学病毒学研究的重大课题。目前，对HBV检测通常使用的酶联免疫吸附实验（ELISA）。它虽然能给我们提供较为准确的乙肝免疫指标（HBVm），但存在一些缺点，如免疫交叉现象，周期长，灵敏度低等。乙肝DNA探针的具体用发为用一个特定的DNA片段制成探针，与被测的病毒DNA杂交，从而把病毒检测出来。与传统方法相比具有快速、灵敏的特点。传统的检测一次，需几天或几个星期的时间，精确度不高，而用DNA探针只需一天。据报道，能从1t水中检测出10个病毒来，精确度大大提高。用乙肝DNA探针有三个优点，首先这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，DNA探针不易降解(相对RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶活性。另外DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。基于乙肝病毒的多种属和变异性，诊断探针必须具有普遍性才可以有效地对病毒的多种亚型及变异性进行有效诊断，这时就迫切需要获得乙肝病毒的高度保守区来满足这一需求。材料与方法 （一）寻找保守区 利用生物信息学软件NCBI找出人乙型肝炎病毒的部分基因，序列如下：1 atggggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacggca121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggacagcac gccgattggg cctagaacaa241 ccacggccca cccctccgcc catcacgtgg acagaagaag aagacaaaaa ggccaaggag301 ttcttcaaac aataccagga gaatcgtccg aaacccgccg agacggcacc acctcccatc361 accgagttac acgctgcaga gcctcctcag tggaagattt caccagaaga cccgctgtta421 aaggccaagg cgctcatccc cgtcaaggaa ccggaggtac cgatcctcaa agttccaaaa481 ctcccgaaca aaaagaaaat gggagctacc ttcgggggaa tactagctgg cctaataggg541 ttactggtag gatttttctt gttgacaaaa attctagaaa tactgaggaa gctagactgg601 tggtggattt ctctcagttc tccaaaggaa aaaatgctat gcggtttcca aaatactggt661 gcccaaacct caccacatta cgtaggatcc tgcccgtggg catgcccagg atttctctgg721 acttatctca ggctttttat catcttcctc ttgctcctgc tagtagtagc cggcttgctg781 tttctgacgg aaaacaagtc tactattttc gaaaagctcc aatgggagtc ggtctcagcc841 ctttcctcct ccatttattc actactgcca tcggagccga aatctctagt cgctttaacg901 tttggacttt ttcttatatg gacgacttcc tcctctgtca cccaagtgct cgtcacctta961 actcaattag ccacgctgtc tgcacttttc ttcaagaatt cgggataa（题目：Heron hepatitis B virus isolate D preS/S protein gene,complete cds；CDS:1-1008)利用NCBI软件的domain & structure中的CD-search功能可以找到上述核苷酸序列的保守区，结果为1 MGHTQAKSTTDRRVEGGELLLQHLAGRMIP.4.GPI.4.KFPTIQH VMDHIDSVEELRTLQAGGHWPEGT 72点击进入可以得到整个核苷酸序列翻译所得的氨基酸序列： 1 mghtqakstt drrveggell lqhlagrmip pefsgpitta gkfptiqhvm dhidsveelr 61 tlqagghwpe gtarrlgldq prptpppitw teeedkkake ffkqyqenrp kpaetapppi 121 telhaaeppq wkispedpll kakalipvke pevpilkvpk ltnkkkmgat fggilaglig 181 llvgfflltk ileilrkldw wwislsspke kmlcafqntg aqtsphyvgs cpwgcpgflw 241 tylrlfiifl llllvaagll fltenkstif eklqwesvsa lsssiysllp sepkslvalt 301 fglfliwtts ssvtqvlvtl tqlatlsalf fknsg（二）保守区序列的获得方法法一：限制性内切酶酶切在的NEBcutter功能中对上述核苷酸序列进行限制性酶切位点分析，找出符合要求的限制性内切酶。按照所需酶的作用条件对其DNA序列进行消化，反应条件如下： Reaction system: Buffer name: NEBuffer 2+BSASalt: 50 mM NaClMain: 10 mM Tris-HClpH: 7.9Mg: 10 mM MgCl2SH: 1 mM DTTBSA: 100样品提取液：100lReaction temperature: 37 °C Reaction time: 1 hour酶切之后对所获得基因片段进行电泳，获得所需的保守区片段。接下来可把获得的保守区片段重组到噬菌体中，经体外包装感染大肠埃希菌，在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后，将目的基因DNA片段再次亚克隆到大肠埃希菌质粒中保存，以便需要时扩增。法二：PCR特异性扩增 dNTP；Taq DNA聚合酶；Mgd2；10×buffer；特异性引物Up primer:5 atggggcata cccaagcaaa 3共20个碱基，Tm=10*4+10*2=60Down primer:5 tgtccc ctccggccaa tg 3共18个碱基，Tm=12*4+6*2=60PCR扩增总体积20ulHBV DNA模板 2ul10×反应buffer 2ul4种dNTP各种 1ul×4 0.2mmol/L引物Up primer与Down primer 3ul×2 0.5dmol/LTap DNA聚合酶 1ul 60个单位/L双蒸水 5ul循环过程：94 1min55 2min72 3min循环30次72，保温7min，反应同步设阴性对照，取2ul扩增产物，用AflIII酶在水解缓冲液酶切，并加水至10ul，在琼脂糖凝胶中电泳，对扩增产物进行鉴定。然后将其克隆到大肠埃希菌的质粒中保存。结果与分析（一） 寻找保守区保守区与整个氨基酸序列比对，可是1-72位氨基酸为保守区，其对应的核苷酸序列为：1 atggggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacggca121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggaca（二）两种方法获得的保守区序列结果法一：酶切结果：酶切分析结果如下图：由上图可找到剪切得到保守区序列的酶Ecil，并可得到此酶的详细信息：Recognition site:5'.G G C G G A(N)11. 3'3'.C C G C C T(N)9. 5'Site in sequence:Ecil酶切片段为：1 atggggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacggca121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggacagcac gccgattggg cctagaacaa241 ccacg法二：PCR扩增片段为：1 atggggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacggca121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggaca讨论 本实验主要对人乙肝病毒S基因保守区进行研究，使用限制性内切酶水解及PCR特异性扩增得到保守区片段。 随着人类对基因操作技术的日益成熟，可以在利用生物信息学软件找到人乙肝病毒S基因保守区序列之后，人工合成该保守区序列作为PCR特异性扩增的模板和扩增产物检测的阳性对照。确切的模板及阳性对照可以减少杂质的干扰，提高扩增产物的精确性，这是制备HBV-DNA探针的关键，也为日后应用该探针进行乙肝检测的准确性和减少假阳性的产生。 接下来的工作是利用多种DNA探针标记方法进行特异性标记。【参考文献】黄桢祥. 医学病毒学基础及实验技术M. 北京：科学出版社，1990: 358-405.少敏，阮康成. 核酸荧光探针新进展J. 生命的化学，1998,（1）:36-38.李弘华. HBV核酸光敏生物素探针的制备J.湖北职业技术学院学报，2003,6（3）：71-73.
