木霉菌素和嘧霉胺复配剂防治抗药性灰霉病(修改稿).doc

木霉菌素和嘧霉胺复配剂防治抗药性灰霉病王国平2，曾邵平2，徐 彬2，章初龙1,2（1.浙江大学 生物技术研究所，杭州 ；2.浙江大化浙大生物药物研发中心，杭州 ）摘要：目的由于嘧霉胺作用位点单一，加上连年使用和不合理的提高用药量，许多地方产生了严重的抗药性，为了延长嘧霉胺的使用寿命，降低抗药性和使用成本。方法将木霉菌素和嘧霉胺2种作用机制不同的药剂进行复配，通过复配制剂的共毒系数、室内离体试验和盆栽药效评价。结果发现木霉菌素与嘧霉胺19进行复配，共毒系数达171.1，盆栽药效比嘧霉胺单一防效高21.4%。结论该复配增效明显，具有推广的应用价值。关键词：木霉菌素；嘧霉胺；复配；抗药性；灰霉病中图分类号：S482.2 文献标志码：A 文章编号：Prevention and Control of Drug-resistant Botrytis cinerea Using the Mixed Preparations of Trichodermin and Pyrimethanil WANG Guo-ping2, ZEN Shao-ping2, XU Bing2, ZHANG Chu-long1,2(1.Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou , China; 2.Zhejiang Dahua Zhejiang University Biomedicament R&D Center, Hangzhou , China)Abstract：The fungicide pyrimethanil has a single action site. Serious drug resistance has developed in many places because pyrimethanil has been used for years and applied in unreasonably high doses. In order to extend the useful life of pyrimethanil and to reduce the drug resistance and the cost, a composition was produced based on trichodermin and pyrimethanil which have different mechanisms. The co-toxicity coefficient of the complex fungicide was tested and the efficacy was evaluated indoor and in pot plants. The results showed that the co-toxicity coefficient was 171.1 by using the complex of trichodermin and pyrimethanil with a ratio of 1:9. Its efficacy in the pot plant was 21.4% higher than that of pyrimethanil. In conclusion, this complex has obvious synergistic action and possesses popularization and application value.Key words: trichodermin, pyrimethanil, complex preparation, drug resistance, gray mold rot 由灰葡萄孢菌侵染所致的番茄、黄瓜灰霉病可引起2030的损失，各地均有发生，保护地设施栽培更为严重。目前还未发现灰霉病抗源材料，因此难以通过抗病育种来防治，目前生产上主要通过化学药剂来控制病害的发生与流行。嘧霉胺（Pyrimethanil）属苯胺基嘧啶类合成杀菌剂，为当前防治灰霉病当家品种，它通过抑制病原菌浸染酶的产生来阻止病菌侵染，具有低毒、无致畸、致癌和致突变等特点。由于嘧霉胺作用位点单一1，加上许多农民习惯连年使用、一季喷洒多次和不合理的提高用药量，导致其成为高抗药性风险杀菌剂，国内外均有报道灰霉病对嘧霉胺产生了严重的抗药性2-8。木霉菌素为红豆杉内生真菌紫杉木霉（Trichoderma taxi）次生代谢产物，对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、稻梨孢菌（Pyricularia oryzae）、终极腐霉（Pythium ultimum）和尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp cucumber）等多种植物病原菌均具有很强的抑制活性9-13，是真核生物蛋白合成延伸与终止的优良抑制剂14，在弱酸或弱碱性环境下稳定，属低毒低残留微生物源农药，而且它的作用机制和嘧霉胺不同。农药毒性及环境友好性越来越受到人们重视，选用高效低毒低残留的新型农药成为趋势。嘧霉胺为低毒低残留化学合成农药，近年来抗药性问题导致其使用受到限制，混用和复配是延长老品种农药的使用寿命、缓解靶标生物的抗药性、扩大防治谱、提高药剂防效和环境安全性的主要手段。通过不同作用机制药剂复配来延缓病原菌抗药性，同时可提高药剂防效。课题组针对目前嘧霉胺抗药性的问题，开展了木霉菌素和嘧霉胺复配研究。通过测试复配制剂的共毒系数、室内离体试验和盆栽药效评价，发现木霉菌素与嘧霉胺1：9进行复配，共毒系数达171.1，盆栽药效比嘧霉胺防效高21.4%，增效明显，具有很好应用推广价值。 1 材料与方法1.2 材料1.2.1 供试药剂10%木霉菌素水乳剂（木霉菌素），浙江大化生物科技股份有限公司，批号；40%嘧霉胺悬乳液（施佳乐），德国拜耳（中国）公司拜耳作物科学，批号。1.2.2 供试菌株嘧霉胺抗药性菌株，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers（蕃茄灰霉病菌），浙江大学生物技术研究所马忠华教授提供。1.2.3 培养基马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）。1.2.4 供试作物番茄品种为上海番茄研究所上海长征良种实验场提供的合作903大红番茄，市售，批号。番茄种经高锰酸钾浸种消毒，在28 培养箱中催芽48 h，然后在育苗盘中育苗，待3叶1心移栽至直径10 cm的花盆中，每盆1株，5叶期用于试验。1.2.5 主要仪器人工气候箱（XT5408-CC380TLH，杭州雪中炭仪器有限公司），pH测定仪（TOLEDO 320，METTLER公司），超净台（ZHJH-1209C，上海智诚仪器有限公司），显微镜（BX51，OLYMPUS光学有仪公司），高效液相色谱仪（Waters的1525二元高压梯度泵、Waters2487检测器，Breeze工作站，美国waters公司），高压喷雾器（1/8 HP(0.095)-118，USA）。1.3 方法1.3.1 供试药剂及复配制剂对灰霉病菌的毒力测试采用菌丝生长速率法测试木霉菌素、嘧霉胺及其复配制剂对灰霉病菌的毒力系数，各供试药剂分别用无菌水稀释成系列梯度质量浓度后加入PDA培养基，制成最终浓度（为有效成份）分别是250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98、0.49 mg/L的含药平板。每个梯度3个重复，并设以无菌水为空白对照。直径5 mm不锈钢打孔器在病原菌菌落边缘打取菌饼，并将菌饼反接于培养皿中央。25 培养至对照皿菌丝生长接近培养皿边缘时，用十字交叉法测量各药剂处理皿的菌落扩展直径。用下式计算抑制率：抑制率（%）= 利用DPS统计软件，采用剂量对数-抑菌率机值法计算求得半抑制浓度（EC50）及毒力回归方程。1.3.2 复配制剂的联合共毒系数评价根据各药剂测定结果，采用剂量对数-抑菌率机值法计算求得半抑制浓度（EC50），利用Y.P.Sun和E.R.Johnson方法计算复配剂的共毒系数15，并根据共毒系数大小来评价复配剂增效作用，并确定最佳配比。毒力指数(TI)=标准杀菌剂EC50/供试药剂EC50×100；复配制剂实际毒力指数(ATI)=标准药剂EC50/混剂EC50；复配制剂剂理论毒力指数(TTI)=单剂A的TI×PA+单剂B的TI×PB，(PA和PB分别是混剂中单剂A和单剂B有效成分的百分含量)；复配制剂共毒系数(CTC)=混剂的实际毒力指数ATI/混剂的理论毒力指数TTI；增效作用判断：CTC>120时为增效作用；CTC<80时为拮抗作用；80CTC120时为相加作用。1.3.3 复配制剂药效离体试验试验共设4个处理：10%木霉菌素水乳剂稀释至有效成份浓度为100 mg·L-1；40%嘧霉胺悬浮液稀释至有效成份浓度为400 mg·L-1；木霉菌素:嘧霉胺1:9混剂（10%的有效成份）稀释至有效成份浓度为400 mg·L-1；空白对照。选取番茄植株相同部位叶片，在相应的药剂溶液中浸泡510 s后取出自然凉干，每处理20片。将处理后的叶片正面朝上，放置在滤纸覆盖的培养皿中，滤纸上滴加配制好并灭菌的营养液，将直径为5 mm的灰霉病菌菌饼反接于叶片中央，在湿度95%，25 的人工气候箱中，滴加营养液保持叶片湿润。72 h后调查发病情况，用卡尺测量病斑直径，根据病斑扩散直径计算病情指数和防效。试验重复3次，利用DPS统计软件以Duncan法检验差异显著性（下同）。1.3.4 复配制剂盆栽药效试验木霉菌素与嘧霉胺复配混剂药效盆栽试验于2010年36月在浙江大学华家池校区温室内进行，共设4个处理：10%木霉菌素水乳剂稀释至有效成份浓度为100 mg·L-1；40%嘧霉胺悬浮液稀释至有效成份浓度为400 mg·L-1；木霉菌素:嘧霉胺1:9混剂（10%的有效成份）稀释至有效成份浓度为400 mg·L-1；空白对照。选取长势基本相同，5叶期的番茄植株为测试材料。采用喷雾接种法将灰霉菌孢子液均匀地喷撒于叶片表面（灰霉病孢子液浓度为1×1095×109个/L，添加0.5%的吐温-20），待叶片表面基本无水珠后再用高压喷雾器喷撒试验药剂溶液，每处理10盆，设3个重复。7 d后调查和记录每个处理的病斑总数及病斑面积，并进行第2次施药；2次施药7、14 d再进行病情调查，计算病情指数和防治效果，试验调查及分级标准参照农药田间效试验准则（一）16。2 结果与分析2.1 木霉菌素与嘧霉胺复配制剂的毒力系数从表1分析数据可以看出：试验所选用的灰霉病菌对嘧霉胺具有明显的抗药性，对木霉菌素较为敏感。利用Y.P.Sun和E.R.Johnson计算方法，木霉菌素与嘧霉胺19和28的质量比进行复配时共毒系数（CTC）分别为171.7、131.3，大于120的标准值，具有显著的增效作用，其它各配比共毒系数(CTC)均在80120之间，无明显的增效或拮抗，作用表现为相加。表1 木霉菌素与嘧霉胺复配制剂的毒力系数 供试药剂毒力回归方程（y=）rEC50值/(mg·L-1)95%置信区间CTC10%木霉菌素水乳剂5.0456+1.1935x0.990.920.771.0840%嘧霉胺悬乳液 2.4814+1.3681x0.9936.1624.1858.64木霉菌素嘧霉胺=19 4.3910+1.0072x0.984.022.587.00171.7 28 4.4750+1.1409x1.002.882.423.48131.3 37 4.5446+1.1069x0.992.582.003.42101.0 11 4.8704+1.0561x0.991.321.051.69119.7 73 4.9217+1.2422x0.991.160.941.42100.4 82 4.8776+1.3731x1.001.231.121.3682.9 91 5.0640+1.4035x1.000.900.830.98101.12.2 木霉菌素与嘧霉胺复配制剂离体药效试验联合毒力测试结果表明：木霉菌素与嘧霉胺19和28的质量比进行复配共毒系数均大于120，增效显著，综合药剂成本和增效比率，木霉菌素与嘧霉胺19为最佳配比，因此下面的药效测试均以木霉菌素与嘧霉胺19质量比进行复配。离体药效测试结果（见表2）表明：木霉菌素与嘧霉胺19复配剂稀释成有效质量浓度为400 mg/L时防效达到82.6%，明显高于相同质量浓度嘧霉胺的药效，与100 mg/L的木霉菌素防效差异不明显。表2 木霉菌素和嘧霉胺19复配剂离体防效供试药剂质量浓度/(mg·L-1)病情指数相对防效/%10%木霉菌素水乳剂1006.0784.9 Aa40%嘧霉胺悬乳液40011.7770.7 Bb木霉菌素嘧霉胺=194006.9882.6 Aa空白对照040.23注：英文字母小写、大写分别代表5%、1%显著水平的差异显著性。2.3 木霉菌素与嘧霉胺复配剂盆栽药效试验第1次施药7 d后病情调查发现：木霉菌素与嘧霉胺1:9复配剂稀释成有效浓度为400 mg/L时的防效明显高于相同质量浓度的嘧霉胺，但比100 mg/L木霉菌素防效差；第2次施药14 d后复配剂防效达到83.3%，与木霉菌素的防效相当，比单独使用嘧霉胺防效高21.4%，复配剂增效明显，见表3。表3 木霉菌素和嘧霉胺19复配剂对番茄灰霉病盆栽防效供试药剂质量浓度/(mg·L-1)1次药后7 d2次药后7 d2次药后14 d病情指数相对防效/%病情指数相对防效/%病情指数相对防效/%10%木霉菌素水乳剂1006.1474.3 Aa9.0380.1 Aa8.3187.9 Aa40%嘧霉胺悬乳液40012.2248.9 Cc19.7556.5 Cc26.1761.9 Bb木霉菌素嘧霉胺=194008.2265.6 Bb11.1175.5 Bb11.4783.3 Aa空白对照23.9345.3768.69注：英文字母小写、大写分别代表5%、1%显著水平的差异显著性。3 讨论混用和复配是延长老农药品种使用寿命、缓解靶标生物抗药性、扩大防治谱、提高药剂防效和环境安全性的主要手段。随着病虫害抗药性发展和活性新化合物发现难度增加，世界各国对农药混剂的研究都非常重视，通过复配延缓病害药剂抗药性，减少开发费用和缩短研发周期。农药复配混剂近年来发展迅速，截止2006年底在我国农业部农药检定所登记的混剂品种占52.3%。杀菌剂的混剂一般是强的内吸性药物和非内吸性药物混配，或者高成本的药物与低价格的药物混配，或者是作用对象不同的药物混用，复配混剂的增效是各种因素综合效应的集中体现。杀菌剂嘧霉胺由于应用时间较长，许多地区都出现严重的抗药性，由此导致许多病害防治失败。但是嘧霉胺通过抑制病菌浸染酶的产生来阻止病菌侵染的作用机构比较独特，对其它靶标生物还具有低毒和无致畸、致癌、致突变的优点，因此嘧霉胺还是有它的应用价值。木霉菌素为内生真菌紫杉木霉次生代谢产物，能强烈地抑制灰霉病菌，是真核生物蛋白合成延伸与终止的优良抑制剂，它的作用机制与嘧霉胺完全不同，但其生产成本较高，这为它们之间的复配提供了基础条件。通过平皿测试共毒系数以及离体叶片与温室盆栽试验，表明了木霉菌素与嘧霉胺混剂对番茄灰霉病菌的毒力有增效作用，木霉菌素与嘧霉胺1：9配比增效最佳，混剂共毒系数（CTC）为171.7，盆栽试验中防治抗药性的番茄灰霉病的效果达到83.3%，与10%木霉菌素水乳剂效果相当，比对照药剂嘧霉胺防效提高21.4%，增效明显，具有很好的应用推广价值。参考文献： 1LATORRE B A, SPADARO I, RILJA M E. Occurrence of Resistant strains of Botrytis cinerea to Anilinopyrimidine Fungicides in Table Grapes in ChileJ. Crop Protection, 2002, 21(12): 957-961.2HILBER U W, SCHUKEPP H. A Reliable Method for Testing the Sensitivity of Botryotinia fuckeliana to Anilinopyrimidines in vitroJ. Pesticide Science, 1996, 47(3): 241-247.3HILBER U W, SCHUKEPP H. Mycelial Growth Test for Assessment of Anilinopyrimidine Sensitivity of Grey Mould (Botryotinia fuckeliana) J. EPPO Bull, 1996, 26: 184-186. 4RUEEGG J, LAUBER H P, SIEGFRIED W, et a1. Experiences with Anilinopyrimidines in SwitzedandJ. Pesticide Outlook, 1997, 8(3): 28-33. 5王文桥, 马志强, 张小风, 等. 植物病原菌对杀菌剂抗性风险评估J. 农药学学报, 2001, 3(1): 6-11.6丁中, 刘峰, 慕立义. 不同抗性型灰葡萄孢Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究J. 农药学学报, 2001, 3(4): 59-63.7张传清, 张雅, 魏方林, 等. 设施蔬菜灰霉病菌对不同类型杀菌剂的抗性检测J. 农药学学报, 2006, 8(3): 245-249.8印利梅, 礼茜, 李红叶. 浙江省茄科蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性J. 浙江农业学报, 2007, 19(2): 123-126.9 王国平, 鲁素琳, 郑必强, 等. 内生真菌紫杉木霉ZJUF0986菌株及其活性代谢产物防治水稻纹枯病的效果J. 中国生物防治, 2009, 25(1): 30-3410 王国平, 郑必强, 章初龙, 等. 内生真菌ZJUF0986代谢的抗菌活性物质特性J. 植物保护学报, 2008, 35(2): 127-131.11 章初龙, 王国平, 郑必强, 等. 紫杉木霉ZJUF0986抗真菌活性代谢产物分离提取及其活性研究J. 菌物学报, 2008, 27(3): 439-44612 刘小红, 张福生, 王国平, 等. ZJUF0986活性代谢产物对稻瘟病菌致病性的影响J. 植物保护学报, 2008, 35(6): 481-485.13 王国平, 鲁素琳, 郑必强, 等. 紫杉木霉ZJUF0986代谢产物及其对番茄灰霉病的抑制作用J. 浙江农业学报, 2008, 20(2): 104-108.14 ERIC C, JULIAN E.D. Inhibition of Initiation, Elongation, and Termination of Eukaryotic Protein Synthesis by Trichothecene Fungal ToxinsJ. Anitimicrobial Agents and Chemotherapy, 1977, 11 (3): 491-499.15 SUN Y P, JOHNSON E R. Analysis of Joint Action of Insecticides against House FliesJ. Journal of Economic Entomology, 1960, 53(5): 887-892.16 农业部农药检定所. 农药田间药效试验准则(一)M. 北京: 中国标准出版社, 1998: 45-51.收稿日期：2013-01-21，修回日期：2013-02-06基金项目：杭州市科技计划项目种子基金（K156）；国家863课题微生物杀菌剂研究与产品创制（2011AA10A205）；公益性行业（农业）科研专项（）作者简介：王国平（1974），男，浙江建德人，工程师，研究方向为应用微生物。Tel：0571-，E-email：yuiop380。通讯作者：章初龙。Tel：0571-，E-mail：clzhang。责任编辑：赵平