甘肃农业大学组培实验报告.doc

植 物 组 织 培 养实 验 报 告学院：生命科学技术学院班级：10生物技术(植)学号：姓名：王庆植物组织培养实验报告实验一 植物组织培养母液的配制一 、实验目的1.了解植物组织培养基本培养基的组分及其作用。2.学习掌握植物组织培养MS培养基的配制方法。二 、实验原理培养基是植物组织培养中离体组织赖以生存和发育的条件。大多数培养基的成分是有无机盐、有机化合物（碳源、维生素、肌醇、氨基酸等）、生长调节物质、水分和其他附加物等五大类物质组成。无机盐类由大量元素和微量元素组成。大量元素中，氮类化合物主要以硝酸类和铵类化合物的形式存在，但在培养基中多用硝酸类，也可以将硝酸类和铵类混合使用；磷和硫常用磷酸盐和硫酸盐来提供；钾是培养基中主要的阳离子；钙、钠、镁的需要量较少。微量元素包括碘、锰、铜、锌、钴、铁。培养基中的铁离子，大多数以螯合物的形式存在，即硫酸亚铁与乙二胺四乙酸二钠的混合。有机化合物包括碳源、维生素、肌醇、氨基酸等。培养中的植物组织和细胞的光合作用较弱，因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物物来提供营养需要。培养基中的碳水化合物通常为蔗糖。蔗糖除了作为培养基的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起着重要的作用。在培养基中加入维生素有助于细胞的分裂和增长。一般包括VB1、B6、烟酸、生物素、叶酸、泛酸钙、VC。肌醇在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的催进作用。常用的植物生长调节物质包括以下三类：生长素类：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）细胞分裂素：玉米素（ZT）6-苄基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）。赤霉素：组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。培养基中的其他附加物包括人工合成和天然的有机物附加物。其中最为常见的为酵母提取物。琼脂作为培养基的支持物，也是最常用的邮寄附加物，他可以是培养基呈固体状态，以利于组织和细胞的培养。植物组织培养是否成功，在很大的程度上取决于培养基的选择之上。目前普遍使用的是MS培养基。MS固体培养基可用于诱导遇上组织，或用于胚胎、茎段、茎尖及花药的培养等。MS培养基的硝酸盐、钾和铵的含量略高于其他的培养基，也是它被普遍使用的原因之一。三 、实验材料、试剂、配方和仪器设备 1试剂NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2·2H2O ,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O Na2-EDTA,MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇， 烟酸，蒸馏水。2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml） ， 容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药匙，称量纸等。3、培养基配方各种母液的吸取量药品名称扩大倍数1L培养基吸取母液的量（mL）大量元素10100微量元素10010铁盐10010有机10010蔗糖30g琼脂0.8gPH5.8-6.3MS培养基大量元素母液配制化合物名称培养基浓度(mg/L)称取质量(g)NH4NO3165041.25KNO3190047.50KH2PO41704.25MS培养基微量元素母液配制化合物名称培养基浓度(mg/L)称取质量(g)MnSO4·4H2O22.355.7ZnSO4·7H2O8.621.5H3BO36.211.5KI0.8320.75Na2MoO4·2H2O0.256.25CuSO4·5H2O0.00250.625CoCl2·6H2O0.00250.625MS培养基铁盐母液配制化合物名称培养基浓度(mg/L)称取质量(g)FeSO4·7H2O27.86.95Na2-EDTA37.39.32MS培养基有机物质母液的配制化合物名称培养基浓度(mg/L)称取质量(g)肌醇1002甘氨酸20.2烟酸硫胺素0.48盐酸吡哆醇0.510烟酸0.510MS培养基钙盐和镁盐母液的配制化合物名称培养基浓度(mg/L)称取质量(g)CaCl2·2H2O44011MgSO4·7H2O3709.25四、 实验步骤1 、计算：计算各化学成分所需要的量。大量、微量和盐类按扩大50倍，定容500ml的配制计算。有机和肌醇按扩大100倍，定容200ml的配制计算。计算后制成配方表。2、制定标签：裁取适当大小的牛皮纸，用铅笔写上MS，种类，并标明此类母液所含物质，质量，定容体积，扩大倍数吸取量，制备人，制备日期以大量为例如图： MS钙盐母液CaSO4·2H2O定容 500ml吸取量 20mL/L制备人： 王庆配制日期： 2012.9.103、大量元素母液的配制 ：先用量筒量取300ml蒸馏水放入 500ml 烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取： NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一种化合物完全溶解后再 加入第二种化合物，溶解过程用玻璃棒搅拌，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至 500ml 容量瓶中，并用蒸馏水将烧杯和玻璃棒洗涤3次，每次约50ml，而后用蒸馏水定容至 500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，并置于冰箱中低温保存备用。4、微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平依次称取 MnSO4·4H2O, ZnSO4·7H2O， H3BO3, KI, Na2MoO4·2H2O。CuSO4·5H2O和 CoCl2·6H2O先稀释后用移液管吸取,按制备母液 I 的方法逐个溶 解，转移至容量瓶中，洗涤烧杯，然后定容至 500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明 母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。5、 铁盐母液的制备 把 FeSO4·7H2O 和 Na2-EDTA 分别置于适量蒸馏水中，加热搅拌使之完全溶解，保持加热，把 FeSO4 倒入 Na2-EDTA 溶液中并搅拌，接近沸腾时停止加热，冷却后调 PH 到 5.5，将溶液转移至 500ml 容量瓶中，洗涤后用蒸馏水定容至 500ml，转入细口试 剂瓶中，用力振荡 12min，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期， 配制人，并置于冰箱中保存备用。6、 有机化合物母液的制备按配方表中用量依次称取：盐酸硫胺素,盐酸吡哆醇，烟酸, 甘氨酸，用蒸馏水溶解后，定容200ml转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人， 并置于冰箱中保存备用。7、植物生长物质母液制备 NAA 母液:准确称取 10mg,用少量 1mol/L NaOH 溶解后加蒸馏水定容至 100ml,即 配制成 0.1mg/ml 的 NAA 母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称， 放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 6BA 母液配制方法相似，浓度为 2mg/ml五、试验结果分析及注意事项1、配制母液时注意药品只能出不能进。2、制作标签时只能能用铅笔写，防止油性笔字迹在高压灭菌后模糊不清。实验二、培养基的制备与灭菌一 、 实验目的1、学习母液法配制培养基。2、学习用牛皮纸包三角瓶口的防污染方法。3、学习并熟悉自动化灭菌锅的操作和保护。二 、 实验原理 为防止组织培养各物质发生反应所以把微量和铁盐混在一起，为了避免物质的反应，所以要迅速倒入沸腾的蒸馏水中，琼脂应慢慢倒入，并边搅拌边倒入。组织培养所用的培养基含有植物生长所必需的各类营养物质， 同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必须对培养基灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。三 、 实验材料、试剂和仪器设备1.试剂： 琼脂，蔗糖，蒸馏水，1mol/L NaOH,各类母液2.仪器设备：电子天平，烧杯，量筒，移液管，玻璃棒，药芍，称量纸，PH 试纸，锥形瓶，牛皮纸，棉塞等。四、 实验步骤1.准备 将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿放在指定置。2 .大量的量取 取 50ml量筒一个，将大量、有机、肌醇、镁盐，钙盐、按配方表中的用量依次称取并倒入500ml烧杯中。3 .微量铁盐的量取 取 50ml 量筒一个，将微量和铁盐按配方表中的用量称取并倒入100ml烧杯中。 4.培养基配制 取瓷盆一个，加入 1.5L 蒸馏水，置于电磁炉上加热，将称量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不断搅拌。再称量琼脂 16 克，白砂糖 60 克，依次倒入瓷盆中，边倒入边搅拌，待琼脂和白砂糖完全溶解后，并定容至 2L。5、调PH 用 1mol/L NaOH 和1molL HCl调 PH 至 6.0。6、 分装 把培养基分装到三角瓶中，每瓶约50ml，用棉塞塞好再用牛皮纸，细绳包扎好，待灭菌。7、灭菌 将所有的三角瓶整齐的放在灭菌锅的铁丝篮中，将温度调为121灭菌20min。灭完后摆放在水平的实验桌上勿动。五、 试验结果分析及注意事项 1、配制培养基前先大致估计一下药品数量，不够时提前配制。 2、三角瓶灭菌时注意要放干净冷空气。3、加的药品种类较多，切忌加错。4、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮纸包好。5、灭完菌的三角瓶勿动，等待培养基冷却凝固。6、琼脂不可加太快，以防加太快琼脂结块。 实验三 无菌植株的建立一 、 实验目的1、通过实验，初步掌握外植体材料的消毒。2、学习超净工作台灭菌方法和操作要求。3、学习掌握无菌接种操作技术。二 、 实验原理 植物细胞具有全能型，其外植体接种在无菌的人工培养基上，给予适当的条件能长成完整的无菌植株。三 、 实验材料、试剂和仪器设备豌豆，1% 84消毒液，0.5升汞溶液，超净工作台、培养基，镊子，酒精灯，喷雾器。四、 实验步骤1.准备 打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照 20min后关闭紫外灯，同时将豌豆种子用自来水冲20min关闭紫外灯后在台上点燃 2 个酒精灯，用棉球将镊子烧4次，超净作台少2次。将灭菌溶液，无菌水， 豌豆，大烧杯等放入超净工作台。 2.灭菌 在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用酒精倒入种子瓶中约23消毒一次（1-2s）接着用无菌水冲洗一次。再用84 消毒液摇晃清洗清洗 3 次，每次 5 分钟，清洗完后用无菌水冲洗一次。而后用 0.5%HgCI 泡8min，处理 2 次，每次 5 分钟。后用无菌 水摇晃清洗 4-5次。3.接种 将所要用的三角瓶用75的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入超净工作台。接着将灭菌处理好的材料在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入向下倾斜的锥形瓶杯中，每个瓶内装 4 粒豌豆，接种过程中锥形瓶应一直保持向下倾斜，直到接种完毕盖上棉塞。4.标记 接种完毕后，用棉线绑好用铅笔在牛皮纸标上制作人，日期和“陇豌一号”，放入有光的培养架上。五、 试验结果分析及注意事项1.豌豆在自来水下不能冲洗太长，以免影响发芽率。2.在豌豆灭菌时注意升汞、酒精灭菌时间应严格注意， 过长会对种子活性造成影响。3.升汞有剧毒，操作要小心。4.接种时瓶口一定要在酒精灯火焰上方，瓶口要朝下以减少污染率。实验四 脱分化培养基的制备一、 实验目的1、 学习脱分化培养基的制备。2、 熟悉MS培养基与脱分化培养基的异同。二、 实验原理 脱分化所用到的化学物质与MS培养基最大的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养基需要在MS培养基的基础上添加激素进行愈伤诱导。三 、实验材料、试剂和仪器设备 MS培养基的大量，微量，钙盐，镁盐，铁盐，有机，肌醇和0.1mg/ml 的 2，4-D，0.1mg/ml的6-BA，琼脂，糖，1molL的NaOH，1molL的HCl，三角瓶，棉塞，牛皮纸，烧杯，量筒，移液管，玻璃棒，PH试纸。四、实验步骤1.准备 将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿放在指定置。2 .大量的量取 取 50ml量筒一个，将大量、有机、肌醇、镁盐，钙盐、按配方表中的用量依次称取并倒入500ml烧杯中。3 .微量，铁盐的量取 取 50ml 量筒一个，将微量和铁盐按配方表中的用量称取并倒入100ml烧杯中。4.激素的量取 用移液管量取6ml 0.1mgmL的6-BA ，用量筒量取30ml 0.1mgL的2，4-D一并到入50ml的小烧杯中。4.培养基配制 取瓷盆一个，加入 2L 蒸馏水，置于电磁炉上加热，将称量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不断搅拌。接着把激素加入，边倒入边搅拌再称量琼脂 15克，白砂糖 90克，依次倒入瓷盆中，边倒入边搅拌，待琼脂和白砂糖完全溶解后，并定容至 3L。5、调PH 用 1mol/L NaOH 和1molL HCl调 PH 至 6.0。6、 培养基分装 把培养基分装到60个三角瓶中，每瓶约50mL，用棉塞塞好再用牛皮纸，细绳包扎好，待灭菌。7、灭菌 将所有的三角瓶整齐的放在灭菌锅的铁丝篮中，将温度调为121灭菌20min。灭完后摆放在水平的实验桌上勿动，等待凝固。五、试验结果及注意事项 注意事项1、三角瓶灭菌时注意要放干净冷空气。2、加的药品种类较多，切忌加错。3、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮纸包好。4、灭完菌的三角瓶勿动，等待培养基冷却凝固。5、琼脂不可加太快，以防加太快琼脂结块。实验五 豌豆茎、叶愈伤组织的建立一 、实验目的1、学习组培接愈伤操作技术。2、了解最佳接愈伤的植物组织部位。3、通过诱导豌豆茎、叶形成愈伤组织学习愈伤组织的建立方法。二 、实验原理植物细胞具有全能性，已经分化的植物细胞在适宜条件下可脱分化形成愈伤组织。三 、实验材料、试剂和仪器设备超净工作台、无菌豌豆苗、培养基、剪刀、镊子、喷雾器、酒精灯。四、实验步骤1.器具灭菌 把酒精灯、剪刀、镊子放入超净工作台中，打开紫外灯照射20min后点燃酒精灯，用沾有酒精的棉球点着，把剪刀和镊子烧3次。2.材料入台 取5瓶无菌豌豆苗和4瓶培养基用75的酒精用喷雾器喷湿，并把手喷湿后把无菌豌豆苗和培养基放入超净工作台中。3.接种 用灭菌后的弯头剪 刀分别剪取长势良好，无病菌污染的豌豆的根茎、叶每个锥形内各接一种，每种接 2瓶，接种时瓶口要朝下。接完后标记将接种好的锥形瓶标记，写上名字，日期，叶 L,茎 S。标记好后放置在暗处培养。五、 试验结果及注意事项 注意事项1、接种根时注意取接近根尖但不能直接是根尖部分2、接种时总体为接种材料大小越少越好，越有利于愈伤组织的形成。 3、接种时可以适当按压材料使之更有利于愈伤组织的形成。实验六 发芽率、感染率的计算及结果展示一、发芽率的计算接苗数发芽数发芽率3瓶*4个1083%二、导致发芽率低的原因1、培养条件的温度太低。2、种子在升汞中泡太久。3、接种时胚朝下。4、接种前种子已经死亡。5、接种时镊子过热导致种子死亡。三、污染率的计算接种数（瓶）污染数（瓶）污染率（%）5480三、 导致高污染率的原因1. 接种时手接触到了棉塞的下半部分。2. 接种时剪子和镊子反复使用造成染菌的几率大幅提升。3. 接种仪器已有多人使用，造成染菌可能性增加 陇豌一号 发芽的苗 接种叶片 接种茎