地衣芽孢杆菌发酵培养基的优化.pdf
地衣芽孢杆菌发酵培养基的优化丰贵鹏,杨丽云(新乡学院化学与化工学院,河南新乡453003)摘要 目的 对地衣芽孢杆菌发酵培养基进行优化,并在此基础上确定最佳培养条件,为实现其工业化生产提供参考。方法 借鉴谷春涛等关于地衣芽孢杆菌TS21液体培养发酵条件的研究成果,对培养基进行澄清,并运用单因素试验和4因素3水平正交试验对其培养基进行改进,对地衣芽孢杆菌发酵条件进行优化以得到其最佳温度、pH 值和接种龄。结果 4 种因素对地衣芽孢杆菌发酵影响的显著性次序为:玉米浆 豆饼粉浸汁 蛋白胨 葡萄糖。培养基的最佳配比为:玉米浆 0.45 g,蛋白胨 1.50 g,豆饼粉浸汁为1 15,葡萄糖1.50 g。最适宜种龄为18 h,接种量 8%,起始 pH 值 7.5,最佳温度 37.5,此条件下地衣芽孢杆菌对数生长期在1420 h,发酵周期为 2224 h。活菌数每单位提高近1 亿个,发酵周期比经验周期缩短10 h。结论 试验得出了地衣芽胞杆菌发酵培养基的最佳配比及最佳培养条件,在此条件下培养,收获菌体量大大提高,降低了生产成本,更有利于其大规模工业化生产。关键词 地衣芽孢杆菌;发酵;培养基优化;正交试验中图分类号 S182文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)15-06862-03R esearchon the Optimization of the Medium forBacillus licheniformisFermentationFENG Gui2penget al(Instituteof Chem istry and Chem ical Engineering,XinxiangCollege,Xinxiang,Henan453003)Abstract Objective Onthe basisof theoptimizationof theBacillus licheniformisfermentationmedium,thebestculture conditionwasdeterm inedforthereference for theimplem entationof its industrial production.Meth od On the basisof theresultsfrom Gu Chuntao in the liquid culturefermentationconditionofBacillus licheniformis2TS 21,thefurthertestof theculturemediumwasconducted,andthe ex perimentin the mediumimprovem entfor bacilluslicheniform is was d one with the single 2factororthogonal testwith 4 factorsand 3 levelsfor theoptimumtemperature,pH valueandageof inoculation.Results Theorderof fourkindsof factorssignificantlyimpactingthefermentationofBacillus licheniformiswasasfollows:cornjuice steepliquorfrombeancakepowder peptone glucose,andthebestcontainin the mediumwas0.45 gcornsteepliquor,1.50 gpeptone,theratioof steepliquor frombeancakepowderin themediumof 1 15 and1.50g glucose.The mostappropriate inoculationagewas18 h ours;inoculationam ount,8%;theinitial pHvalue,7.5 andthe besttem perature,37.5;underthe condition,the logarithm ic grow th timeof bacilluslicheniform is appeared from the14th to 20thhour,andthefermentationperiodwas22-24 hours.The number of viablecellsper unit wasraisedto near100million cells andthecycleof theferm en2tation wassh ortenedfor m ore than10 h ours.C onclusion The bestBacillus licheniformisfermentationmediumandcultureconditionwereobtained,underthecondition,theharvested biom asswasgreatlyimprovedandtheproductioncostwasreduced,whichwasm ore conducive to its large 2scaleindustrialpro2duction.Key words Bacillus licheniformis;Ferm entation;MediumOptimization;Orthog onal test作者简介 丰贵鹏(1982-),男,河南新乡人,助教,从事生物化工方面的教学与研究。收稿日期 2009203202地衣芽孢杆菌是我国20世纪90年代起开发利用的新型微生态制剂,它的消长直接影响该制剂的疗效和产量的高低。目前在国内已有一定的应用,但长期以来生产成本一直居高不下,为此笔者对地衣芽孢菌发酵过程进行了优化试验,以求提高产量,降低生产成本1。国内已有许多学者对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行研究,但有的所用培养基为实验室常用的葡萄糖、酵母浸膏、尿素等,工业生产成本难以大幅度降低2。谷春涛等关于地衣芽孢杆菌TS21液体培养发酵条件的研究,详实具体,大量试验数据论证得到了地衣芽孢杆菌的一种新的廉价培养基,使其生物量达到了前所未有的水平1。但是他们采用的豆饼粉造成了培养基的浑浊,很大程度上制约了该成果的应用。笔者借鉴其研究成果,对培养基进行了澄清,并运用单因素试验和4因素3水平正交试验对其培养基进行了改进,对地衣芽孢杆菌发酵条件进行了优化,从而得到了最佳温度和pH值,发现了接种龄对发酵周期的影响。1 材料与方法1.1材料1.1.1 菌种。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),由新乡学院化学与化工学院实验室提供(经鉴定为地衣芽孢杆菌)。1.1.2 培养基。种子培养基1:牛肉膏5 g、大豆蛋白胨10g、NaC l 5 g、水1 L、pH值7.0、0.1 MPa灭菌20 min。经验培养基1:葡萄糖20g、豆饼粉70 g、玉米浆7 g、水1L、pH值7.0、0.1 MPa灭菌20 min。发酵培养基:组成见表1,pH值7.0、0.1 MPa灭菌20min。1.1.3 仪器设备。蒸汽消毒器;恒温培养箱;回转式恒温调速摇瓶柜;紫外分光光度计;精密pH计。1.2 方法1.2.1 基本培养方法。1.2.1.1 种子液的制备。将地衣芽孢杆菌从保存的斜面转接于新鲜试管斜面,于37培养18 h。取培养好的斜面,用接种环挑1环接种于盛有50 ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中,然后置回转式恒温调速摇瓶柜中37振荡培养24h,转速为120 r/min。1.2.1.2摇瓶培养。分别取种子液,超净工作台上接入盛有50ml无菌种子培养基的250 ml三角瓶中,接种量为10%(V/V)。置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养,转速为120r/m in,37 培养30 h。培养结束取样测定活菌数。1.2.2 活菌计数方法。1.2.2.1平皿活菌计数法。采用倾注法按10倍稀释法制成不同浓度稀释液,从3种合适的稀释液中分别吸取0.2 ml置于无菌培养皿中,每一稀释度做3个平皿。将事先融化并冷却至50左右的牛肉膏蛋白胨培养基,向每个培养皿中倒入约10 ml摇匀,待凝固后,37倒置培养进行菌落计数。1.2.2.2OD值比浊法3-4。在平皿活菌计数法的基础上采用分光光度计法比浊计数,取发酵液1015 ml在1 600r/m in下离心10 min,取1 m l分别稀释5、10、15、20、25、30倍,以去离子水为参比池,756 MC紫外分光光度计在600 nm下测OD值。平皿活菌计数法对离心后的1 ml菌液计数,按安徽农业科学,Journalof Anhui Agri.Sci.2009,37(15):6862-6864责任编辑 李菲菲 责任校对 况玲玲稀释倍数计算得不同OD值下的菌数分析数据,从而得到标准工作曲线。1.2.3单因素试验。以经验培养基为基础进行单因素试验,单因素改变培养基组成,分别测定不同培养基下菌种的消长变化。经验培养基:葡萄糖1 g、豆饼粉3.5 g、玉米浆0.35 g(为采用OD值法计数首先按15,110,115,120将豆饼粉浸泡煮沸取汁50 ml配置培养基考察豆饼粉与水的最佳比例),将得到的各发酵液稀释后以去离子水为参比池,紫外分光光度计在600 nm下测得的OD值与标准工作曲线对照得到菌体浓度。1.2.4 摇瓶正交试验5。结合单因素试验结果,设计4因素3水平正交试验,每种培养基做2个重复,共18瓶。通过正交试验对地衣芽孢杆菌的发酵培养基在摇瓶中进行优化,将各发酵液稀释后以去离子水为参比池,紫外分光光度计在600 nm下测得的OD值与标准曲线对照得到菌体浓度。综合分析直观法结果与单因素试验结果,得到最佳培养基。2 结果与分析2.1标准工作曲线 设所求直线为y=kx+b,在波长600nm下,建立菌液的OD值与其活菌数之间的直线回归方程:y=2.003 7x+0.021 2 x为OD值,y为菌浓度(亿个/ml)(10倍稀释),见图1。图1地衣芽孢杆菌OD值和活菌数的关系Fig.1Relationship betweenODvalueand active bacteria number ofBacilluslicheniformis2.2 单因素试验结果按豆饼与水的比例为15、110、115、120、125将豆饼粉浸泡煮沸取各50 ml,按葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、玉米浆0.35 g配培养基5瓶(10倍稀释OD值)。活菌数依次为4.12、5.52、6.82、7.11、7.25亿个/ml。按葡萄糖0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g,115将豆饼粉浸泡煮沸各取50 ml,蛋白胨1 g、玉米浆0.35 g配培养基5瓶(10倍稀释OD值)。活菌数依次为4.23、5.16、6.01、7.05、7.32亿个/ml。按玉米浆0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 g,葡萄糖2.0 g、115将豆饼粉浸泡煮沸取各50 ml,蛋白胨1 g配培养基5瓶(10倍稀释OD值)。活菌数依次为4.41、5.56、6.81、7.12、7.43亿个/ml。按蛋白胨0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g,葡萄糖2.0 g,115将豆饼粉浸泡煮沸取各50 ml,玉米浆0.35 g配培养基5瓶(10倍稀释OD值)。活菌数依次为4.41、6.54、7.12、7.29、7.51亿个/ml。参考豆饼粉与水各比例试验结果,分析单因素试验结果。由图2可见,豆饼粉与水115的比例处开始菌液浓度增长率变小,取115作为正交试验中豆饼粉与水比例的3水平中间水平,110与120做为另两个水平。以菌液浓度增长率变化作为依据,同理分析各因素试验结果可以将115将豆饼粉浸泡煮沸取50 ml、葡萄糖2.0 g、蛋白胨1.0 g、玉米浆0.35 g等作为正交试验中3水平的中间水平,与其相临两个水平做为正交试验的基本数据来设计正交试验。图2豆饼粉与水各比例示意Fig.2Different proportion of bean cake powder and water2.3 正交试验与结果分析 由表1可以看出,4种因素对地衣芽孢杆菌发酵影响的显著性次序为:玉米浆豆饼粉浸汁蛋白胨葡萄糖。培养基的最佳配比为:玉米浆0.45 g,蛋白胨1.5 g,豆饼粉浸汁为115,葡萄糖1.5 g。发酵液中菌液浓度达到8.5亿9.0亿个/ml。表1 正交试验结果T able 1The resu lts of the orthogonal experiment试验号T est No.豆饼粉浸汁Juice of s oybeancakemeal葡萄糖G lucose玉米浆Corn steepliquor蛋白胨Peptone活菌数亿个/mlViable bacterianumber11(110)1(1.5 g)1(0.25 g)1(0.5 g)6.24212(2.0 g)2(0.35 g)2(1.0 g)6.42313(2.5 g)3(0.45 g)3(1.5 g)8.6242(215)1237.36522318.55623126.4173(120)1328.35832136.17933216.53K17.0937.3176.2737.107K27.4407.0476.7707.060K37.0177.1878.5077.383极差Range0.4230.2702.2340.3232.4接种龄影响 接种龄对发酵周期的影响见图3。分别以培养15、17、19、21、23 h的种子接种于发酵培养基中,36发酵20 h。结果18 h种龄的种子接入发酵培养基20 h后菌液浓度最高。18 h的种子液,接出时的生理特征主要有:pH值为67,外观稍黏稠、色泽微红、镜检观察菌粗壮且形态呈竹节状(10倍稀释OD值)。2.5 接种量影响 接种量对发酵周期的影响见图4,将18 h种龄的种子培养基以不同的接种量接入发酵培养基,经摇瓶振荡培养20 h后,测定。其中,以8%的接种量为最好。2.6 起始pH值影响 起始pH值对菌液浓度的影响见图368637卷15期 丰贵鹏等 地衣芽孢杆菌发酵培养基的优化文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 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h后。从图5可以看出,pH值影响较大,其中,起始pH值为7.58.0时,菌液浓度最高。注:图中为10倍稀释OD值。下图同。Note:ODvaluein thefigurewasdilutedfor 10times.Thesam eas below.图3OD值与菌种活化时间的关系Fig.3Relationship betw eenODvalueand activation time of bacteria图4OD值与接种量的关系Fig.4Relationship betweenODvalue and inoculation amount图5OD值与起始pH值的关系Fig.5Relationship betweenODvalue and initial pH value2.7 温度影响 种龄18 h,接种量为8%,起始pH值7.5。20 h后检测,发现37 左右菌液浓度最大,高温低温下增殖缓慢,温度低对菌体生长影响更大(图6)。2.8摇瓶发酵过程的生长曲线绘制 活化18 h,接种量为图6OD值与培养温度的关系Fig.6Relationship betweenODvalue and culture temperature8%,起始pH值7.5培养温度37.5。发酵培养12 h后,每2 h抽样检测菌液OD值。得到地衣芽孢杆菌的对数生长期在1420 h,24 h后菌液变化很小说明已经进入生长平衡时期,应该在此时间收集菌体(图7)。图7发酵过程中OD值变化Fig.7The changesofODvalue in the fermentation process3 结论4种因素对地衣芽孢杆菌发酵影响的显著性次序为:玉米浆豆饼粉浸汁蛋白胨葡萄糖。培养基的最佳配比为:玉米浆0.45 g,蛋白胨1.5 g,豆饼粉浸汁为115,葡萄糖1.5 g。最适宜种龄为18 h,接种量8%,其始pH值7.5,最佳温度37.5,此条件下地衣芽孢杆菌对数生长期在1420h,发酵周期为2224 h。活菌数每单位提高近1亿个,发酵周期比经验周期缩短10 h。参考文献1 谷春涛,彭爱铭,萨仁娜,等.地衣芽孢杆菌TS21发酵培养基的优化J.饲料工业,2003(8):19-20.2刘莹,孙荣丹,杨翔华,等.地衣芽孢杆菌LNPU21发酵条件研究及培养基优化J.食品科技,2006(8):28-30.3乔军,孟庆龄,贾桂珍.OD值法进行细菌计数的研究J.中国家禽,1996(4):26.4俞俊棠,唐孝宣,邬行彦.新编生物工艺学(上)M.北京:化学工业出版社,2003:111.5马远中,薛兆民.乳酸乙脂最佳合成工艺的正交试验设计J.荷泽师专学报,1998(4):42-44.4686 安徽农业科学 2009年文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 ZG3O9D5X4I1文档编码:CF7Q9C2J6N9 HH7A7D8Q9Y8 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