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实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)Log Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的域值的循环数即循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量www.tw-qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量25讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用www.tw-非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -DNA -DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQRwww.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1-1-SYBR Green 法SYBR Green www.tw-SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitationwww.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度TmTmTm值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)(-dI/dT)-dIdTTmwww.tw-SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物非特异性产物www.tw-Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量www.tw-SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同www.tw-天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNAwww.tw-SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。www.tw-SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2-TaqMan2-TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针www.tw-TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光www.tw-TaqMan TaqMan 法法 PCR PCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同www.tw-已肝病人血液中HBV的绝对定量q目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据q方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测q设置对照：浓度为106、105、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照q实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序q结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数天为时代公司利用天为时代公司利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBVwww.tw-数据分析分析结果：HBV DNA的精确copy数为3.7X105天为时代公司利用天为时代公司利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBVwww.tw-TaqManTaqMan法法 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 目的基因定量q 产物鉴定q SNP分析www.tw-TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3-Molecular beacon 3-Molecular beacon 法法(分子信标分子信标)标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针www.tw-Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（FRET）q 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号www.tw-Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)应用范围应用范围 q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析www.tw-Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)优缺点优缺点q高高特异性：特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNADNA和体外转入的和体外转入的RNA RNA www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品DNADNADNADNA拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释分子量换算成拷贝数，做系列稀释www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线q 相相对对定定量量确确定定经经过过不不同同处处理理的的样样本本目目标标转转录录本本之之间间基基因因的的表表达达差异（不同时相）差异（不同时相）v 2 2-C C（t t）v 双标准曲线法双标准曲线法www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 TaqMan TaqMan法举例法举例TaqMan法研究法研究ERBB2 在乳腺肿瘤在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异www.tw- TaqMan TaqMan法举例法举例 标记探针标记探针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q Fam Fam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针www.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 材料准备材料准备q从正常乳腺组织中提取的从正常乳腺组织中提取的总总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 总总RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线的质粒用于生成标准曲线q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析qq ControlsControls no RNAno RNA：阴性对照阴性对照 RNA+no reverseRNA+no reverse transcriptase transcriptase：基因组对照基因组对照www.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 反应程序反应程序 RT-qPCR 反应程序：反应程序：50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate read10C,foreverEnd35 more timeswww.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 癌症标记物表达癌症标记物表达Color2-VICdetectionforGAPDHColor1FAMdetectionforERBB2www.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 单双通道相互验证A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex reactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24www.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量定量Copiesng/lTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45Xwww.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量分析定量分析ERBB2 copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/lTotalRNAwww.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 表达差异表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异www.tw-TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 讨论讨论通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基因在基因在不同组织的不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的的表达量是正常水平的1.8倍倍www.tw-实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 SYBR Green I SYBR Green I法举例法举例利用利用SYBR Green 1进行进行GMO定量定量(SGI)for GMO soy detection(SGI)for GMO soy detectionwww.tw- SYBR Green I SYBR Green I法法 GMO GMO概念概念 转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。www.tw- SYBR Green I SYBR Green I法法 GMO GMO概念概念1983198319831983年：首例转基因植物转基年：首例转基因植物转基年：首例转基因植物转基年：首例转基因植物转基因烟草因烟草因烟草因烟草1986198619861986年：转基因植物首次进入田年：转基因植物首次进入田年：转基因植物首次进入田年：转基因植物首次进入田间实验间实验间实验间实验1994199419941994年：首例转基因植物产品年：首例转基因植物产品年：首例转基因植物产品年：首例转基因植物产品Flavr Savr Flavr Savr Flavr Savr Flavr Savr 延熟保鲜转基因番延熟保鲜转基因番延熟保鲜转基因番延熟保鲜转基因番茄进入市场茄进入市场茄进入市场茄进入市场1996199619961996年至今：转基因作物迅猛年至今：转基因作物迅猛年至今：转基因作物迅猛年至今：转基因作物迅猛发展期发展期发展期发展期www.tw- SYBR Green I SYBR Green I法法 检测方法检测方法q 转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因q 通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization)q 利用插入基因的定量来进行GMO含量检测www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法法 材料准备材料准备q Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）q 普通非转基因大豆q 从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品：大豆饼,豆制甜点 和两个牌子的大豆粉www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法法 样品制备样品制备标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%,0.1%,0.5%,1%,2%和 5%转基因大豆实验样本 从含大豆成分的样本中提取DNADNA from Standard/SamplePCR mixGMO primersTUBE 1TUBE 2PCR mixLectin primerswww.tw-SYBR Green ISYBR Green I法法 引物设计引物设计Lectin 扩增片段长度为318bp 其引物为：正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3，反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3EPSPS 扩增片段长度为356bp 其引物为：正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3 反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3 www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法法 CC（t t）定量）定量 log A/B =logA-logB A:EPSPS GMO B:Lectin all bean A/B:%GMO%GMOC（t）www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 数据收集与分析数据收集与分析q 标准曲线标准曲线log%GMOlog%GMO对应对应C C（t t）获得获得q 熔解曲线分析，检测扩增产物熔解曲线分析，检测扩增产物数据处理：数据处理：数据处理：数据处理：C C（t t t t）EPSPSEPSPS-C C（t t t t）lectinlectinlectinlectin=C C（t t t t）处理条件：处理条件：处理条件：处理条件：假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 熔解曲线分析熔解曲线分析Tm=92oC熔解曲线熔解曲线 Lectin 扩增扩增Tm=88.5oC熔解曲线熔解曲线 epsps 扩增扩增www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果1:1:标准曲线标准曲线不同转基因成分含量与不同转基因成分含量与Ct epsps做做标准曲线标准曲线Cp4-epspswww.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果2:2:样品的样品的扩增曲线扩增曲线LectinepspsFood Sample#2Food Sample#1www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果：实验结果：定量分析定量分析Standards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin0ND22.60.1ND22.60.528.222.51.027.222.52.026.222.85.024.622.7Soy Dessert24.622.4Soy FlourND22.2Soy Burger24.223.4www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果 定量分析定量分析1.Calculate C(t)=C(t)epsps C(t)lectinStandards/SampleC(t)epspsC(t)LectinC(t)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0.528.222.55.61.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9Soy Dessert24.622.42.1Soy FlourND22.2NDSoy Burger24.223.40.7www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果 标准曲线生成标准曲线生成y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456C(t)LogpercentGMO2.2.根据根据 C(t)C(t)值与标准品百分含量做标准曲线值与标准品百分含量做标准曲线www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMOGMO实验结果实验结果 GMOGMOGMOGMO定量定量定量定量 Standards/SampleC(t)%GMO0ND0.1ND0.55.61.04.72.03.45.01.9Soy Dessert2.14.40Soy FlourND 53.3.根据根据 C(t)C(t)值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 实验结果实验结果 讨论讨论用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？v阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品v分别提取分别提取DNADNAv紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度www.tw-SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 讨论讨论 PCRPCRPCRPCR扩增效率扩增效率扩增效率扩增效率 看两个反应是否具有相同的扩增效率的看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是：方法是：v cDNAcDNA样品在样品在100100倍浓度梯度稀释后倍浓度梯度稀释后扩增产物扩增产物C CT T如何变化如何变化v 斜率绝对值接近于斜率绝对值接近于0 0为保证上述假定成立，即ExA=ExB扩增子长度扩增子长度引物设计引物设计模板纯度、复杂度等模板纯度、复杂度等反应条件反应条件www.tw-天为时代感谢各位光临!免费咨询：免费咨询：800-810-2177800-810-2177技术支持热线：技术支持热线：010-62521767 62521767010-62521767 62521767武汉特约代理商武汉特约代理商武汉凌飞科技有限公司武汉凌飞科技有限公司联系电话：联系电话：027-87199371 027-87199371 13007149237 结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！71
