实验二 pcr技术及应用().ppt

实验二实验二PCR技术及应技术及应用用(2012)8.jpg实验三PCR技术及其应用实验目的实验目的(Objective)掌握掌握PCRPCR基本原理和方法基本原理和方法熟悉熟悉PCRPCR技术的应用技术的应用PCRPCR技术的诞生技术的诞生Kary MullisKary MullisPCRPCR技术发明人技术发明人7.jpgPCR7.jpgPCR技术基本原理技术基本原理PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCRPCR由变由变性性-退火退火-7.jpg-7.jpg延伸三个基本反应步骤构成。延伸三个基本反应步骤构成。PCPC7.jpgR7.jpgR反应五要素：反应五要素：参加参加PCRPCR反应的物质主要有五种即引物、酶、反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和MgMg2+2+PCRPCR反应体系反应体系 标准的标准的PCRPCR反应体系：反应体系：1010扩增缓冲液扩增缓冲液4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 引物引物 模板模板DNA DNA Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 MgMg2+2+加双蒸水至总体积加双蒸水至总体积 一、一、PCRPCR操作步骤操作步骤(Methods)在冰浴中，按照以下次序将各种成分加入在冰浴中，按照以下次序将各种成分加入一个薄壁离心管中，一个薄壁离心管中，PCRPCR总体系总体系2525l。2PCRMixbuffer 12.5 12.5l7.jpg引物引物1 1(10pmol)0.50.5l引物引物2 2(10pmol)0.50.5lDNA模板模板(1ng/l)1 1l加加ddHddH2 2O O至至2525l，混匀。视，混匀。视PCR仪有无仪有无热盖，不加或添加石蜡油。热盖，不加或添加石蜡油。设定反应程序，将上述混合液置设定反应程序，将上述混合液置PCRPCR仪中进行扩仪中进行扩增。扩增条件为：增。扩增条件为：5.jpg5.jpg9494预变性预变性2 min2 min5.jpg94 30s 58 30s 72 30s5.jpg94 30s 58 30s 72 30s 循环循环2525次次最后在最后在7272，保温，保温10min 10min 二、二、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理(Principles)1.1.体外体外DNADNA分子的热变性和退火分子的热变性和退火2.2.体细胞分裂中体细胞分裂中DNADNA的半保留复制机理的半保留复制机理3.dNTP3.dNTP存在时，耐热存在时，耐热Taq Taq DNADNA聚合酶使聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链引物沿单链模板延伸成为双链DNADNA5.jpg5.jpg5.jpg5.jpg三、三、PCRPCR的基本过程的基本过程PCR 三步曲三步曲30s30s30s25-30cycles变性变性94C退火退火58C延伸延伸72CPCRPCR引物的设计引物的设计引物设计原则：引物设计原则：1.1.引物的特异性引物的特异性:2.2.引物长度引物长度:一般为一般为151530bp 30bp 3.3.碱基分布：四种碱基最好应随机分布碱基分布：四种碱基最好应随机分布 4.3 4.3端要求：端要求：33端必须与模板严格互补端必须与模板严格互补 5.5 5.5端无严格限制：端无严格限制：可以进行特异修饰（标记、设置酶可以进行特异修饰（标记、设置酶切位点等）切位点等）引物设计软件：引物设计软件：四、基因工程操作过程四、基因工程操作过程 总结总结1.分分离并获取载体和目的基因离并获取载体和目的基因2.载体和目的基因的限制酶载体和目的基因的限制酶切切3.载体和目的基因的重组连载体和目的基因的重组连接接4.重组重组DNADNA的的转转化和扩增化和扩增5.重组重组DNADNA的的筛筛选和鉴定选和鉴定PCRPCR获取目的基因的方法获取目的基因的方法:RT-PCR:RT-PCR五、结果观察五、结果观察(Observationofresults)PCRPCR结束反应，取结束反应，取1010l扩增产物，加扩增产物，加1 1l DNA 染色试剂染色试剂SyberGreen，电泳，电泳检测。检测。在波长为在波长为254nm254nm的紫外灯下，观察染色后的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。的电泳胶板。DNADNA存在处显示出绿色的荧存在处显示出绿色的荧光条带。光条带。双酶切鉴定电泳结果双酶切鉴定电泳结果PCRPCR产物电泳结果产物电泳结果六、思考题六、思考题(Questions)PCRPCR扩增与细胞内扩增与细胞内DNADNA半保留复制有何异同？半保留复制有何异同？?