工业发酵的生物学原理.ppt

工业发酵的生物学原工业发酵的生物学原理理实验目的：以一株能在胞外大量积累丙酮酸和-酮戊二酸的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)四重维生素的营养缺陷型菌株CCTCC M202019为出发菌株，结合生化工程和基因工程手段，结合生化工程和基因工程手段，调控碳代谢流进入调控碳代谢流进入TCA循环，循环，同时阻断同时阻断-酮戊二酸的进一步酮戊二酸的进一步代谢途径，使碳代谢流从过量代谢途径，使碳代谢流从过量积累丙酮酸转向过量积累积累丙酮酸转向过量积累-酮酮戊二酸，提高戊二酸，提高-酮戊二酸对丙酮戊二酸对丙酮酸的碳摩尔比酮酸的碳摩尔比。总体来讲，要实现-KG高产量必须满足以下两个条件：(1)将更多的碳代谢流通过PDH途径导入TCA循环；(2)(2)阻断碳代谢流通过-KGDH途径的进一步代谢。实验主要内容：(1)以四重维生素缺陷型菌株T.glabrata CCTCC M202019为研究菌株，通过添加-KG脱氢酶抑制剂，降低其活性，同时增加维生素B1浓度，提高PDH途径流量，将碳代谢流导入TCA循环。(2)以T.glabrata CCTCC M202019为出发菌株，通过基因工程手段，敲除编码-KGDH-E1酶的基因kgd1，构建-KGDH活性缺失的重组菌，比较研究重组菌和出发菌株在积累-KG过程中的代谢参数变化，以及能量代谢、碳源代谢和氨基酸代谢的变化，明确-KGDH在细胞代谢过程中的作用和地位。(3)以T.glabrata CCTCC M202019为出发菌株，通过基因工程手段，过量表通过基因工程手段，过量表达编码达编码PDH-E1 亚基的基因亚基的基因pda1，构，构建高建高PDH活性菌株，活性菌株，研究PDH在发酵生产-KG过程中的作用，并进一步推断PDH活性对积累TCA循环中间代谢产物的影响。实验步骤：（略）实验结果与讨论：（3方面）一、抑制抑制-KGDH活性活性 促进促进-酮戊二酸过酮戊二酸过量积累量积累ParametersLimiting Factors-KG(g/L)pyruvate(g/L)CKG/CPYRControl(adding of 0.015 mg/L B1)16.832.60.52Adding of 6 mM H2O221.8(+30.1%)33.0(+1.4%)0.66(+28.4%)Adding of 0.08 M MTX20.5(+22.1%)30.4(-6.8%)0.67(+31.0%)Adding of 6 mM H2O2 and 0.08 M MTX23.5(+40.1%)27.3(-16.2%)0.86(+67.3%)Adding of H2O2,MTX and 0.04 mg/L B128.4(+69.6%)17.4(-46.5%)1.63(+217.3%)二、敲除二、敲除-KGDH-E1基因基因kgd1对细胞代谢及产对细胞代谢及产酸的影响酸的影响 (1)利用酶切连接技术，在体外成功构建了敲除质粒pMD-kgd1:kan，并以该质粒为模板PCR得到敲除组件Kgd1:Kan，转化光滑球拟酵母，筛选得到重组菌T.glabrata kgd1:kan；(2)重组菌-KGDH活性缺失，ICL活性增加了70.7%，说明在-KGDH途径受阻的情况下，细胞选择了增加乙醛酸途径流量来完成碳源的代谢，形成了TCA-乙醛酸循环；(3)丙酮酸族氨基酸 29.3%谷氨酸族氨基酸 34.7%天冬氨酸族氨基酸 26.8%；(5)对重组菌T.glabrata kgd1:kan的发酵特性研究发现，敲除kgd1基因阻断-KGDH途径，同时增加培养基中维生素B1浓度提高PDH途径流量，在一定程度上促进了丙酮酸的降解和-KG的积累，使-KG产量达到22.0 g/L，为对照的133.4%，同时CKG/CPYR值达到1.14，比出发菌提高了1.11倍。三、过量表达过量表达pda1提高提高PDH途径通量促途径通量促进进-酮戊二酸积累酮戊二酸积累 (1)利用酶切连接技术，将来自S.cerevisiae的pda1基因插入穿梭质粒pYX212的多克隆位点，在体外成功构建了表达质粒pYX-PDA1，其酶切和测序结果均与预期结果一致；(2)将表达质粒pYX-PDA1转化T.glabrata ura3感受态细胞，利用遗传互补原理，成功的在MM培养基上筛选得到了一株过量表达PDH活性的光滑球拟酵母T.glabrata-pda1，其胞内PDH表达活性达到0.35 U/mg protein，为出发菌的3.8倍；MM培养基上T.glabrata-pda1的筛选分离Screen of T.glabrata-pda1 on MM (3)比较重组菌与出发菌的发酵过程曲线发现，过量表达pda1基因提高PDH途径通量，可有效促进丙酮酸的进一步代谢，并将碳代谢流导向TCA循环，使丙酮酸残留量降为10.4 g/L，而-KG产量达到31.7 g/L，比出发菌(22.8 g/L)提高38.9%，同时CKG/CPYR值升高至3.05，这将有利于降低后续提取分离工序的成本，促进发酵法生产-KG的工业化。