液相色谱分析法优秀PPT.ppt

学习要求学习要求驾驭液相色谱法的基本原理，了解液相色谱仪的构造，驾驭液相色谱法的基本原理，了解液相色谱仪的构造，液相色谱法的分类。驾驭液相色谱分析方法的选择以及液相色谱法的分类。驾驭液相色谱分析方法的选择以及定性定量分析方法；了解定性定量分析方法；了解HPLC的应用。的应用。学习方法建议学习方法建议1.通过文献查阅，理解方法的应用及与理论的结合点。通过文献查阅，理解方法的应用及与理论的结合点。2.接受对比的方式进行接受对比的方式进行GC与与HPLC异同点比照，有助于异同点比照，有助于对两种色谱方法的理解。对两种色谱方法的理解。3.从仪器结构上讲搞清晰从仪器结构上讲搞清晰“高效高效“的含义。的含义。4.对于高效液相色谱的类型，重点在液对于高效液相色谱的类型，重点在液固色谱法和化固色谱法和化学键合相色谱法的固定相、流淌相的特点及其选择。学键合相色谱法的固定相、流淌相的特点及其选择。第一讲第一讲 概述概述一一 高效液相色谱技术的出现高效液相色谱技术的出现 二、高效二、高效 HPLC HPLC与经典与经典 LC LC 方法的比较方法的比较四、液相色谱分别原理及分类四、液相色谱分别原理及分类三、三、HPLC HPLC 与与 GC GC 的比较的比较 液相色谱是以溶剂液体为流淌相的色谱方法。液相色谱是以溶剂液体为流淌相的色谱方法。早期，是在直径早期，是在直径15cm,长长50 500cm的玻璃柱中进行的。的玻璃柱中进行的。即使这样，流速仍旧很低即使这样，流速仍旧很低(1mL/min)1mL/min)，分析时间仍旧很长！，分析时间仍旧很长！当当加加压压增增加加流流速速(真真空空或或空空气气泵泵)时时，尽尽管管分分析析时时间间削削减减，但柱塔板高度但柱塔板高度HminHmin也相应增加了！或者说柱效下降了。也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们相识到：为了解决分析时间及柱效问题，人们相识到：最为有效地增加柱效的方法是减小填充物的粒径（最为有效地增加柱效的方法是减小填充物的粒径（310 310 m m）！）！直直到到60年年头头，由由于于在在高高压压下下操操作作的的液液压压设设备备、高高效效固固定定相相以以及及高高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。为保证柱流速，固定相颗粒直径多在为保证柱流速，固定相颗粒直径多在150 200 m 范围内。范围内。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。一一 高效液相色谱技术的出现高效液相色谱技术的出现高速：高速：HPLC接受高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，接受高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；经典方法靠重力加料，速度慢需时数小时。只需数分钟；经典方法靠重力加料，速度慢需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍匀整、传质阻力小，高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍匀整、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分别。因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分别。高灵敏度：检测器灵敏度极高：高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g,荧光检测器荧光检测器10-11g。HPLC 具有分析速度快、分别效能高、自动化等特点具有分析速度快、分别效能高、自动化等特点,所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。（最高输送压力可达（最高输送压力可达 4.9 107 Pa）(每米塔板数可达几万或几十万每米塔板数可达几万或几十万)二、高效二、高效 HPLC HPLC与经典与经典 LC LC 方法的比较方法的比较流淌相的选择：流淌相的选择：GC：有限的几种：有限的几种“惰性惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC：接受的流淌相为液体或各种液体的混合，除了起运载作：接受的流淌相为液体或各种液体的混合，除了起运载作用外，可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，用外，可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流淌相对分别的贡献很大，可通过溶剂来限制和改进分别。即流淌相对分别的贡献很大，可通过溶剂来限制和改进分别。分析对象及范围分析对象及范围：GC：只限于气体和低沸点的稳定化合物（占有机物总数的：只限于气体和低沸点的稳定化合物（占有机物总数的20%）HPLC：可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物（占可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物（占80%）操作温度操作温度：GC 需高温；需高温；HPLC 通常在室温下进行。通常在室温下进行。基本理论：基本理论：LC的塔板理论、速率方程与的塔板理论、速率方程与GC基本一样；基本一样；基本概念：基本概念：LC的术语（如保留值等）、定量、定性方法与的术语（如保留值等）、定量、定性方法与GC一样。一样。相同点不同点三、三、HPLC HPLC 与与 GC GC 的比较的比较依据分别机制不同依据分别机制不同HPLC分别的实质分别的实质 依据各组分在固定相及流淌相中的吸附实力、安排依据各组分在固定相及流淌相中的吸附实力、安排系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分别。系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分别。样品分子与溶剂（即流淌相或洗脱液）以及固定相样品分子与溶剂（即流淌相或洗脱液）以及固定相分子间的作用力的大小，确定色谱过程的保留行为。分子间的作用力的大小，确定色谱过程的保留行为。液固吸附色谱液固吸附色谱化合键合色谱化合键合色谱离子交换色谱离子交换色谱分子排阻色谱分子排阻色谱亲和色谱亲和色谱HPLC的分类的分类四、液相色谱分别原理及分类四、液相色谱分别原理及分类其次讲其次讲 高效液相色谱仪高效液相色谱仪岛津岛津HPLC结构结构组成组成一、高压输液系统一、高压输液系统 二、进样系统二、进样系统三、分别系统三、分别系统四、检测器四、检测器 记录系统记录系统结构示意图结构示意图高压泵将储液器中的流淌相经过进样器输入色谱柱，待分别试样高压泵将储液器中的流淌相经过进样器输入色谱柱，待分别试样由进样器注入，随流淌相一起进入色谱柱分别，被分别组分依次由进样器注入，随流淌相一起进入色谱柱分别，被分别组分依次进入检测器，检测信号由记录仪记录或经过数据处理得到色谱图。进入检测器，检测信号由记录仪记录或经过数据处理得到色谱图。He储液瓶储液瓶分布器分布器过滤过滤2 m高压泵高压泵入口检查入口检查出口检查出口检查脉流消除脉流消除抽气抽气过滤器过滤器反压调节反压调节压力计压力计注样阀注样阀分离柱分离柱检测器检测器储液器储液器HPLC 仪器详解仪器详解一、高压输液系统一、高压输液系统 贮液器贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金合金)，其孔很约其孔很约2 m，可防止颗粒物进行泵内。可防止颗粒物进行泵内。脱气：超声波脱气或真空加热脱气。脱气：超声波脱气或真空加热脱气。高压输液泵高压输液泵：由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。梯度洗脱装置：在分别过程中渐渐变更流淌相组成的装置。梯度洗脱装置：在分别过程中渐渐变更流淌相组成的装置。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉 动、可调范围宽、耐腐蚀。动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。输液泵种类：恒压型和恒流型。达到提高分别效果，缩短分析时间的目的。达到提高分别效果，缩短分析时间的目的。低压梯度：假如只有一个泵，可接受低压混合设计低压梯度：假如只有一个泵，可接受低压混合设计（将两种或以上的溶剂按确定比例混合，再由高压泵输出）；（将两种或以上的溶剂按确定比例混合，再由高压泵输出）；高压梯度：如有两个或以上泵，调整各自的流量，在高压下混合。高压梯度：如有两个或以上泵，调整各自的流量，在高压下混合。梯度洗脱方式：低压梯度（外梯度）、高压梯度（内梯度）梯度洗脱方式：低压梯度（外梯度）、高压梯度（内梯度）二、进样系统二、进样系统 与与GC 相相比比，HPLC 柱柱要要短短得得多多，因因此此，由由于于柱柱本本身身所所产产生生的的峰形展宽相对要小些。峰形展宽相对要小些。即即HPLC 的展宽多因一些柱外因素引起。的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。对对进进样样器器的的要要求求：密密封封性性好好、死死体体积积小小、重重复复性性好好、对对系系统统的的压力和流量波动小，便于自动化。压力和流量波动小，便于自动化。（1）隔膜注射进样：）隔膜注射进样：微量注射器进样。装置简洁、死体积小。进样量小且重现性差。微量注射器进样。装置简洁、死体积小。进样量小且重现性差。（2 2）高压进样阀：）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管限制，因此进样精确，重复性好由于进样量可由样品管限制，因此进样精确，重复性好进样方式进样方式装入样品装入样品出口出口进样进样采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进色谱柱进色谱柱六通阀六通阀进样进样进色谱柱进色谱柱出口出口样品量管样品量管三、三、分别系统分别系统三、三、分别系统分别系统内壁光滑的优质不锈钢柱，内壁光滑的优质不锈钢柱，柱形多为直形，内部充微粒固定相。柱形多为直形，内部充微粒固定相。分别系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。分别系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。柱长多为柱长多为1030cm，内径为，内径为25mm色谱柱要求：耐高压、柱接头的死体积尽可能小，色谱柱要求：耐高压、柱接头的死体积尽可能小，柱温一般为室温或接近室温柱温一般为室温或接近室温。常规柱：分析性、制备性常规柱：分析性、制备性快速柱快速柱微量柱微量柱色色谱谱柱柱按柱长和内径不同分类按柱长和内径不同分类四、检测器四、检测器 、记录系统、记录系统两种基本类型的检测器：两种基本类型的检测器：对对HPLC检测器的要求检测器的要求p292溶质型检测器（选择型）溶质型检测器（选择型）仅对被分别组分有响应，仅对被分别组分有响应，如紫外、荧光及电化学检测器等。如紫外、荧光及电化学检测器等。至今还没有即灵敏、通用又可梯度洗脱的检测器。至今还没有即灵敏、通用又可梯度洗脱的检测器。总体检测器（一般型）总体检测器（一般型）对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应。对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应。如示差折光、介电常数检测器等。如示差折光、介电常数检测器等。四、检测器四、检测器 、记录系统、记录系统（一）紫外吸取检测器（应用广泛）（一）紫外吸取检测器（应用广泛）特点：特点：对流量和温度的变更不敏感，适用对流量和温度的变更不敏感，适用于梯度洗脱，检出限可达于梯度洗脱，检出限可达51010 g。溶溶剂剂必必需需能能让让所所选选择择的的光光透透过过，即即所所选选波波长长不不能能小小于于溶溶剂剂的的最低运用波长。最低运用波长。石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电倍增管光电倍增管废液废液原理：原理：依据组分对特定紫外光的选择性吸取，依据组分对特定紫外光的选择性吸取，其浓度与吸光度的关系符合比尔定律。其浓度与吸光度的关系符合比尔定律。HPLC分分析析中中，约约80%的的物物质质可可以以在在254 nm或或280nm处处产产生生紫紫外外吸取。因此该类检测器应用很广。吸取。因此该类检测器应用很广。留意留意（二（二)光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（DAD：Diode Array Detector）可获得吸光度、波长、时间三维彩色图形，得到更多的信息。可获得吸光度、波长、时间三维彩色图形，得到更多的信息。快速扫描紫外可见分光检测器。快速扫描紫外可见分光检测器。快速扫描快速扫描光电二极管阵列（光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱）检测所获得的三维色谱-光谱图光谱图波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮吸吸光光度度(三三)荧光检测器（荧光检测器（Florescence Detector，FD）(四四)示差折光检测器示差折光检测器(Differdntial Refractometer Detector,)（五（五)电化学检测器电化学检测器(六六)化学发光检测器化学发光检测器 很多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。很多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。灵敏度比灵敏度比UV 检测器高检测器高13个数量级；但线性范围不如个数量级；但线性范围不如UV检测器。检测器。灵敏度比灵敏度比 UV 的低，为的低，为10-7g/mL。但对温度变更敏感，且不适于梯度淋洗。但对温度变更敏感，且不适于梯度淋洗。其它检测器：其它检测器：MS、IR等等LC检测器性能一览表了解以上检测器的特点、性能、适用范围、灵敏度等。第三讲第三讲 HPLC方法简介方法简介依据固定相和分别机理不同依据固定相和分别机理不同HPLC分为四类：分为四类：尺寸排阻尺寸排阻（凝胶）色谱（凝胶）色谱离子交换和离离子交换和离子色谱子色谱固体吸附剂固体吸附剂吸附吸附方法固定相平衡类型不相溶液体间的分配不相溶液体间的分配固定液体涂于载体固定液体涂于载体有机基团键合于固体表面有机基团键合于固体表面液体和键合体表面间的分配液体和键合体表面间的分配离子交换树脂离子交换树脂离子交换离子交换液体附于多孔聚合物液体附于多孔聚合物分配分配筛析筛析流淌相：与流淌相：与GC 流淌相不同，流淌相不同，HPLC 流淌相为溶剂（又叫淋洗液、流淌相为溶剂（又叫淋洗液、洗脱剂），它既有运载作用，又和固定相一样，与组分相互作用。洗脱剂），它既有运载作用，又和固定相一样，与组分相互作用。液固吸附色谱液固吸附色谱安排色谱安排色谱键合相色谱键合相色谱液液色谱液液色谱（1）对待测物具确定极性和选择性；）对待测物具确定极性和选择性；（2）与检测器相匹配；）与检测器相匹配；（3）高纯度：否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；）高纯度：否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；（4）化学稳定性好；）化学稳定性好；（5）适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。）适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。志向的流淌相应有下列特性：志向的流淌相应有下列特性：（一）液固吸附色谱（一）液固吸附色谱固定相吸附剂：(硅胶吸附剂应用最广。硅胶吸附剂应用最广。)极性的：无机氧化物、硅胶、氧化铝、分子筛；极性的：无机氧化物、硅胶、氧化铝、分子筛；非极性的：活性碳。非极性的：活性碳。选择流淌相的基本原则：极性大的试样用极性强的流淌相极性小的试样用极性低的流淌相分析对象：分别极性不同的试样或异构体。保留机制：组分分子和流淌相分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，组分分子和流淌相分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，与吸附剂性质类似的简洁被吸附，呈现较高的保留值。与吸附剂性质类似的简洁被吸附，呈现较高的保留值。基于各组分在吸附剂表面上具有不同的吸附实力而分别。基于各组分在吸附剂表面上具有不同的吸附实力而分别。（二）液液安排色谱（二）液液安排色谱流淌相：为防止固定相的流失，流淌相与固定液应尽流淌相：为防止固定相的流失，流淌相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。固定相固定相：常用硅胶为载体，在其表面涂渍固定液。：常用硅胶为载体，在其表面涂渍固定液。常用固定液：按极性由高到低为：常用固定液：按极性由高到低为：,-氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇聚乙二醇(PEM)、十八烷、十八烷(C18)、角鲨烷、角鲨烷(SQ)。正相液相色谱正相液相色谱（Normal-phase Chromatography）反相液相色谱反相液相色谱（Reversed-phase Chromatography）固定相：极性（如水、甲醇）固定相：极性（如水、甲醇）流动相：非极性（如烷烃）流动相：非极性（如烷烃）固定相：非极性（如烷烃）固定相：非极性（如烷烃）流动相：极性（如水、甲醇）流动相：极性（如水、甲醇）主要用于分别极性化合物，按极性小的流出。主要用于分别极性化合物，按极性小的流出。主要用于分别非极性化合物，极性大的先流出，主要用于分别非极性化合物，极性大的先流出，待测物在互不相溶的两相中溶解度不同，故安排系数不同，待测物在互不相溶的两相中溶解度不同，故安排系数不同，被测物在两相间反复多次安排，产生差速迁移，实现分别。被测物在两相间反复多次安排，产生差速迁移，实现分别。保留机制保留机制依据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型。由于固定液与载体松散的结合，固定液易流失，分别稳定性由于固定液与载体松散的结合，固定液易流失，分别稳定性及重现性差，不能接受高流速和梯度洗脱。及重现性差，不能接受高流速和梯度洗脱。机械涂渍型机械涂渍型为削减固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流淌相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。化学键合型化学键合型通过共价键将有机固定液结合到在载体（硅胶）而得到各种性通过共价键将有机固定液结合到在载体（硅胶）而得到各种性能的固定相。能的固定相。键合相色谱键合相色谱（三）键合相色谱（三）键合相色谱固定相分类：按有机基团的性质分：极性、非极性、离子交换等。：按有机基团的性质分：极性、非极性、离子交换等。特点可用于正相色谱和反相色谱，可用于正相色谱和反相色谱，HPLC约约75%运用反相色谱法。运用反相色谱法。固定相（非极性键合相）固定相（非极性键合相）：如十八烷基键合硅胶如十八烷基键合硅胶Octadecysilance、即、即C18又称又称ODS固定相）固定相）流淌相（极性大）：甲醇水、乙腈水、无机盐的缓冲液等流淌相（极性大）：甲醇水、乙腈水、无机盐的缓冲液等多用于多环芳烃等低极性化合物分别；多用于多环芳烃等低极性化合物分别；变更流淌相配比也可分别极性化合物；变更流淌相配比也可分别极性化合物；缓冲液可用于易离解的化合物，如有机酸、有机碱和酚类。缓冲液可用于易离解的化合物，如有机酸、有机碱和酚类。分分析析对对象象可变更流淌相的组成和种类分别极性、非极性、离子型化合物；可变更流淌相的组成和种类分别极性、非极性、离子型化合物；具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点，应用更为广泛。具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点，应用更为广泛。反相反相键合键合色谱色谱各种各种HPLCHPLC方法的应用范围及对象方法的应用范围及对象极性增加极性增加不溶于水不溶于水溶于水溶于水非极性非极性离子离子非离子极性非离子极性吸附吸附反相安排反相安排安排安排正相安排正相安排 离子交换离子交换尺寸排阻尺寸排阻凝胶渗透凝胶渗透凝胶过滤凝胶过滤分分子子量量由于由于HPLCHPLC分别分析的高灵敏度、定量的准分别分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析。确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析。第四讲 高效液相色谱法的应用在工业、科学探讨，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。在工业、科学探讨，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如：氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、如：氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析无机分析无机分析生物化学分析生物化学分析食品分析食品分析应用示例：氨基酸的测定应用示例：氨基酸的测定