激光扫描共聚焦显微镜..优秀PPT.ppt

激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术 Laser scanning confocal microscopy 激光扫描共焦显微镜的设计特点激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面3.具有扫描系统 逐点扫描成像 4.激光作为光源5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物 Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal Microscope人眼辨别率：0.2mm光学显微镜辨别率：0.25mm电子显微镜辨别率：0.2nm共焦显微镜辨别率：0.18mm电子显微镜的缺点：电子显微镜的缺点：1.由于样品须要固定由于样品须要固定,观测活细胞特别困观测活细胞特别困难难.2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象成的假象荧光显微镜的缺点荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光无法实现对荧光,透射光的同时采集透射光的同时采集,无无法实现多荧光的同时采集法实现多荧光的同时采集2.荧光散射光太强，造成实际辨别率的大荧光散射光太强，造成实际辨别率的大大下降。大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。难。4.无法对样品进行断层扫描无法对样品进行断层扫描,完成完成3D的工的工作作.5.对于信号较弱的样本对于信号较弱的样本,无法提高视察的无法提高视察的灵敏度灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠结构高度重叠激光共聚焦显微镜的应用激光共聚焦显微镜的应用单、双、三单、双、三,四色标记检测。四色标记检测。精确的一、二、三、四维视察。精确的一、二、三、四维视察。高品质的荧光成像、透射成像、物体表面高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。反射成像。静态和动态视察静态和动态视察(CA2+,pH,(CA2+,pH,膜电位膜电位,膜流淌膜流淌性等性等)。定性以及定量分析。定性以及定量分析。光谱扫描光谱扫描,ROI,ROI扫描扫描.特殊的光反应特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等等)。时间辨别和快速扫描动态图像精彩的反射光图像明场，DIC,相差和透射光图像 单标，双标和三标图像 激光共聚焦显微成像技术的应用激光共聚焦显微成像技术的应用 一一.定位、定量定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量标）的定位、定量 如：细胞膜受体或抗原的分布，如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的两种或三种蛋白的共存共存与与 共定位共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化细胞凋亡细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI 末端原位杂交末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交：荧光原位杂交：染色体基因定位染色体基因定位单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳GFP的表达的表达活细胞或活体组织静息游离活细胞或活体组织静息游离Ca2+的分布与定量的分布与定量活细胞内活细胞内pH的定量、膜电位的测量的定量、膜电位的测量活细胞内自由基水平的定量活细胞内自由基水平的定量 Helagreen-中心体中心体red-纺锤体纺锤体 Immuno-fluorecence label 二二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组 光学切片和三维重组光学切片和三维重组:LSCM:LSCM通过薄层光学切片功能，可获通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学视察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结视察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。构与组织功能之间的关系。显微显微CT与三维重组与三维重组 3D reconstruction 三三.动态测量动态测量游离游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量测量pH值值的的检测检测 自由基的检测自由基的检测相对相对 测量测量程序化测量程序化测量：用：用timelapse中的中的编程编程按钮按钮可可进行不同时间进行不同时间序列序列的扫描的扫描测量测量 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)四四.细胞膜电位的测量细胞膜电位的测量标记膜电位探针标记膜电位探针(慢反应）：慢反应）：JC1 510nmJC1 510nm 530/590nm 530/590nmioc5(3)548nmioc5(3)548nm 573nm 573nmioc6(3)484nmioc6(3)484nm 500nm 500nm快反应探针：快反应探针：i-4-ANEPPS 496nmi-4-ANEPPS 496nm 703nm 703nmi-4-ANEPPS 498nmi-4-ANEPPS 498nm 713nm 713nm细胞膜静息膜电位：细胞膜静息膜电位：-70mV-70mV线粒体膜电位：线粒体膜电位：-150mV-150mV以上均属于阳离子探针，更简洁与线粒体亲和，为线以上均属于阳离子探针，更简洁与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针粒体膜电位探针 FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching)FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching)原理原理Intense laser BeamBleaches FluorescenceRecovery of fluorescence10 seconds30 secondsZero timeTime%F五五.荧光漂白复原荧光漂白复原(FRAP:Fluorescence Recover after (FRAP:Fluorescence Recover after photobleachingphotobleaching）荧光光漂白后的回复：荧光光漂白后的回复：FRAPFRAP生物膜脂质分子的侧向扩散；生物膜脂质分子的侧向扩散；胞间通讯的探讨；胞间通讯的探讨；胞浆及细胞器内小分子物质转移性胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等的观测等细胞骨架构成、核膜结构及大分子细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。组装等。六六荧荧光光能能量量共共振振转转移移(fluorescence Resonance Energy Transfer)能能量量转转移移：能能量量从从分分子子的的一一个个部部位位向向另另一一个个部部位位的的传传递递，或或能能量量从从一一个个分分子子向向另另一一个个分分子子传传递递。能能量量的的供供应应者者叫叫能能量量供供体体，能能量量的的接接受受者者叫叫能能量量受体。受体。荧光能量共振转移的条件荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体两个荧光分子：供体-FL1，受体，受体-FL2供体与受体的距离在供体与受体的距离在2-7nm供体的放射波长与受体的激发波长一样供体的放射波长与受体的激发波长一样荧光共振能量转移（FRET）技术 生物大分子结构和功能探讨 免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用探讨r:分子间距离 R0:分子间发生50%能量转移的距离 DAr 2R0Dr 2R0Al检测检测l 以以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 l 测测到到 FL1的的放放射射光光(绿绿光光)，发发生生共共振振转转移移时时，就就可可检检测测出出l FL1的荧光的荧光(绿光绿光)减弱，减弱，FL2(红光红光)的增加。的增加。l应用：检测大分子的相互作用应用：检测大分子的相互作用l 大分子构象的变更大分子构象的变更(蛋白蛋白)l 例：大分子例：大分子(亚基亚基)的结合与分别的结合与分别l 受体与配体的结合受体与配体的结合 l l 常用荧光探剂：常用荧光探剂：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP 曲霉养分菌丝横隔不同霉菌自发荧光成像，示一般光学显微镜下不曾视察到的现象微生物自发荧光微生物自发荧光ConfocalConfocal成像成像植物学应用植物学应用:植物细胞中的微管列阵植物细胞中的微管列阵(microtubule array)周质微管早前期微管带纺锤体成膜体农业的应用农业的应用:植物细胞中的微丝分布植物细胞中的微丝分布烟草悬浮培育细胞中的微丝网络烟草悬浮培育细胞中的微丝网络农业的应用农业的应用:花粉萌发过程中微丝骨架的变更花粉萌发过程中微丝骨架的变更农业的应用农业的应用:Jasplakinolide解聚微丝的实时视察解聚微丝的实时视察Zaslavskaia et.al,Martek Biosciences,MD,June 15,2001November 2001;Volume 128(21):pp 4301-4314.Courtesy:Jose-Eduardo Gomes,University of Oregon,USANature,25 April 2002,pg 854GFP-MAP4融融合合蛋蛋白白表表达达显显示示微微管管骨骨架架（美美国国Cyr试试验验室室）奶山羊发育中乳腺上皮细胞主要细胞器的变更 为探讨奶山羊乳腺的胚后形态发育，接受活细胞荧光标记法结合激光共聚焦显微技术，视察奶山羊乳腺发育中主要细胞器的变更。依据奶山羊乳腺发育特点，采样时点分为：妊娠期 1 月、3 月、5 月；泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、7 日、21 日，共计 10 个时点。主要主要试剂试剂及耗材及耗材 DMSO 购购自自 Sigma 公司；公司；优质优质胎牛血清（胎牛血清（FBS）、DF12 培育基、培育基、I型胶原型胶原酶酶均均购购自自 Gibco公司；公司；内内质质网网荧荧光探光探针针（E-34251，激，激发发/放射波放射波长为长为 504/511nm）、线线粒体粒体荧荧光探光探针针（M-7512，激，激发发/放射波放射波长为长为 579/599nm）、Hochest 33258 均均购购自自 Invitrogen公司。公司。Confocal 专专用用细细胞培育皿胞培育皿购购自北京博蕾德科技公司。自北京博蕾德科技公司。奶山羊乳腺上皮奶山羊乳腺上皮细细胞的分胞的分别别培育培育 无菌切取无菌切取 13g 乳腺乳腺组织组织，胶原，胶原酶酶消化法消化法进进行乳腺上皮行乳腺上皮细细胞的分胞的分别别培育。培育。对对胶原胶原酶酶浓浓度及消化度及消化时间进时间进行行优优化，确定最化，确定最适适酶酶浓浓度度为为 400U/ml，消化，消化时间为时间为 3.5 小小时时。以。以 1x106个个/ml的密度的密度铺铺于于 Confocal 专专用用细细胞培育皿中，置于胞培育皿中，置于 5CO2、37恒温培育箱中培育，并恒温培育箱中培育，并视视察察细细胞生胞生长长状况。状况。23 天更天更换换培育液，培育液，视视察察细细胞生胞生长约长约 8090汇汇合度合度时时，进进行行细细胞胞器器荧荧光光检测检测。乳腺上皮乳腺上皮细细胞主要胞主要细细胞器的胞器的检测检测 37预热预热、终浓终浓度度为为50nmol/L的的M-7512工作液，工作液，37染染色色40min；37预热预热、终浓终浓度度为为 1mol/L 的的 E-34251 工作液，工作液，37染色染色 30min10g/ml 的的 Hochest 33258 复染复染 5min图图像采集与数据像采集与数据处处理理 激光激光扫扫描共聚焦描共聚焦显显微微镜镜运用三通道（运用三通道（PMT）检测检测。激激发谱线发谱线：405nm（激（激发发 Hochest 33258 标记标记的的蓝蓝色色荧荧光，染核光，染核 488nm（激（激发发 E-34251 标记标记的的绿绿色色荧荧光，染光，染内内质质网）网）543 nm（激（激发发 M-7512 标记标记的的红红色色荧荧光，染光，染线线粒体）。粒体）。扫扫描模式描模式为为 xyz，以，以0.4m 的的 Z 轴轴步距逐步距逐层扫层扫描，点平均描，点平均 2 次，面平均次，面平均 4 次，三个通道序列次，三个通道序列扫扫描成像，描成像，overlay 处处理后采理后采图图保存。保存。