琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤分析优秀PPT.ppt

琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳Agarose gel electrophoresis 自自然然琼琼脂脂（agaragar）:又又名名琼琼胶胶、菜菜燕燕、冻冻粉粉 是是从从石石花花菜菜及及其其它它红红藻藻类类植植物物提提取取出出来来的的一一种种线线状高聚物。状高聚物。l 琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷D-D-半乳糖半乳糖 核核酸酸凝凝胶胶电电泳泳是是分分子子克克隆隆核核心心技技术术之之一一，用用于于分分别别、鉴鉴定和定和纯纯化化DNADNA或或RNARNA片段片段1.因不含硫酸根和羧基，几乎消退了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构匀整，孔径较大，可用来分别酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。4.透亮度较好，可干脆或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸取紫外光，可干脆利用紫外光吸取法作定量测定6.样品易回收，常用于制备。琼脂糖凝胶电泳的优点缺点缺点1.机械机械强度差，易裂开，度差，易裂开，浓度不能太低。度不能太低。2.易被易被细菌菌污染，不易保存，染，不易保存，临用前配制。用前配制。3.琼脂糖支持脂糖支持层上的区上的区带易于易于扩散，散，电泳后必需泳后必需马上固定染色。上固定染色。4.与与PAGE相比，分子相比，分子筛作用小，区作用小，区带少。少。一、试验目的一、试验目的 驾驭琼脂糖凝胶电泳分别驾驭琼脂糖凝胶电泳分别DNADNA的原理和方法的原理和方法DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。DNADNA分分子子在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中泳泳动动时时，有有电电荷荷效效应应与与分分子子筛筛效效应应。不不同同DNADNA的的分分子子量量大大小小及及构构型型不不同同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、试验原理二、试验原理琼脂糖是一种自然聚合长链状分子，可以形成具琼脂糖是一种自然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小确定。有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小确定。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳法法分分别别DNADNA，主主要要是是利利用用分分子子筛筛效效应应，迁迁移移速速度度与与分分子子量量的的对对数数值值成成反反比比关关系系。因因而而就就可可依依据据DNADNA分分子子的的大大小小使使其其分分别别。该该过过程程可可以以通通过过把把分分子子量量标标准准参参照照物物和和样样品品一起进行电泳而得到检测。一起进行电泳而得到检测。溴溴化化乙乙锭锭（Ethidium Ethidium Bromide,Bromide,EBEB）为为扁扁平平状状分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下放放射射荧荧光光。EBEB可可与与DNADNA分分子子形形成成EB-DNAEB-DNA复复合合物物，其其荧荧光光强强度度与与DNADNA的的含量成正比。据此可粗略估计样品含量成正比。据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。三、试验材料、器具及药品三、试验材料、器具及药品 质粒质粒DNADNA样品。样品。电电泳泳仪仪，电电泳泳槽槽，电电子子天天平平，移移液液器器，枪枪头头，微微波波炉炉，紫紫外透射检测仪等。外透射检测仪等。琼琼脂脂糖糖，1XTBE1XTBE电电泳泳缓缓冲冲液液，溴溴化化乙乙锭锭（EBEB），6X6X载载样样缓缓冲液冲液 四、试验步骤四、试验步骤 1g 1g 琼琼脂脂糖糖加加入入100ml 100ml 1TAE1TAE电电泳泳缓缓冲冲液液中中，摇摇匀匀。在在微微波波炉炉中中加加热热至至琼琼脂脂糖糖完完全全溶溶解解。（冷冷却却到到6060，加加入入100l100l的的0.5mg/ml EB0.5mg/ml EB，并摇匀。），并摇匀。）用用胶胶带带将将制制胶胶板板两两端端封封好好，插插入入适适当当梳梳子子，将将溶溶解解的的琼脂糖（约琼脂糖（约5050）倒入，室温冷却凝固。）倒入，室温冷却凝固。充充分分凝凝固固后后撕撕掉掉两两端端的的胶胶布布，将将凝凝胶胶置置入入电电泳泳槽槽中中，加加1TAE1TAE电电泳泳缓缓冲冲液液至至液液面面覆覆盖盖凝凝胶胶1-2mm1-2mm，当当心心垂垂直向上拔出梳子。直向上拔出梳子。用用移移液液器器吸吸取取总总DNADNA或或质质粒粒样样品品4l4l于于封封口口膜膜上上，再再加加入入2l 2l 的的6X6X载样缓冲液，混匀后，当心加入点样孔。载样缓冲液，混匀后，当心加入点样孔。打打开开电电源源开开关关，调调整整电电压压至至3-5V/cm3-5V/cm，可可见见到到溴溴酚酚蓝蓝条带由负极向正极移动，电泳约条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min30min-60min。将将染染色色后后的的凝凝胶胶置置于于紫紫外外透透射射检检测测仪仪上上，盖盖上上防防护护视视察察罩罩，打打开开紫紫外外灯灯，可可见见到到发发出出荧荧光光的的DNADNA条条带带。将将凝凝胶胶放放入入EBEB染染液液中中染染色色5-10min,5-10min,用用清清水水略略微微漂洗。漂洗。1 2 3 M 1 1、DNADNA分子的大小分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2 2、琼脂糖脂糖浓度度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3 3、DNADNA的构象的构象 同一分子：超螺旋环状线状切口环状DNA的迁移速率确定因素的迁移速率确定因素4 4、凝胶和、凝胶和电电泳泳缓缓冲液中的溴化乙冲液中的溴化乙锭锭 溴溴化化乙乙锭锭（EBEB）插插入入双双链链DNADNA造造成成其其负负电电荷荷削削减减、刚刚性和性和长长度增加。度增加。5 5、所用的、所用的电压电压 低低电压时电压时DNADNA片段迁移率与所用的片段迁移率与所用的电压电压成正比。成正比。6 6、琼琼脂糖种脂糖种类类 常常见见的有两种：的有两种：标标准准琼琼脂糖和低熔点脂糖和低熔点琼琼脂糖；脂糖；不同不同类型型琼脂糖的性脂糖的性质 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖3538353890959095不同厂家生不同厂家生产的不同商产的不同商品其凝结温品其凝结温度和熔化温度和熔化温度有一定差度有一定差异异4042404285908590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖3443344385958595 修饰的低熔点修饰的低熔点/凝凝点琼脂糖点琼脂糖253525356365636535356565 超低熔点超低熔点81581540454045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖2530253070703838858530307575不同不同类型型琼脂糖分脂糖分别DNA片段的范片段的范围浓浓 度度（%）标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低溶低黏度低溶点点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1常用的常用的电电泳泳缓缓冲液冲液4 保存备用保存备用.7、电泳缓冲液、电泳缓冲液TAETAE和和TBETBE电泳泳缓冲液比冲液比较都是常用电泳缓冲液，二者相比：都是常用电泳缓冲液，二者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状）双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的）对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的辨别率略高于的辨别率略高于TBETBE，对于低分，对于低分子质量的子质量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳辨别率中的电泳辨别率要好于要好于TBETBE。凝胶凝胶载样缓冲液冲液载载样样缓缓冲冲液液：临临上上样样到到凝凝胶胶加加样样孔孔之之前前与与待待电电泳泳的的样样品相混合的一种缓冲液。品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其其中中的的染染料料在在电电场场中中以以可可以以预预料料的的泳泳动动速速率率向向阳阳极极迁移。迁移。66凝胶凝胶载样缓冲液冲液类型类型6 6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I I0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝440.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰40%(m/V)40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液IIII0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰15%15%聚蔗糖聚蔗糖(Type400)(Type400)水溶液水溶液IIIIII0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝440.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰30%30%甘油水溶液甘油水溶液IVIV0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝4440%(m/V)40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液琼脂糖凝胶中脂糖凝胶中DNADNA的的检测 通过染色通过染色,紫外灯下检测。紫外灯下检测。主要接受溴化乙锭（主要接受溴化乙锭（ethidium bromide,ethidium bromide,EBEB）染色法。）染色法。运用运用EB染色留意事染色留意事项（1）EB被被认为是一种是一种强致癌物致癌物质（2）EB可用来可用来检测单链或双或双链核酸核酸（3）EB运用运用时的配制、的配制、贮存及运用存及运用 EB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml的的贮存液，于室温保存在棕色瓶存液，于室温保存在棕色瓶或用或用铝箔包袱的瓶中，运用箔包袱的瓶中，运用终浓度度为0.5 g/ml。（4）当要知道）当要知道DNA片段精确大小片段精确大小时，凝胶，凝胶应在无在无EB状况下状况下电泳，泳，电泳泳结束后再用束后再用EB染色。染色。凝胶中凝胶中DNADNA的成像的成像 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成像，染色的凝胶成像，图像可以干脆输出到计算机视察。图像可以干脆输出到计算机视察。关于关于琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳的泳的试验技巧和方法技巧和方法几点留意事几点留意事项1）加）加样时枪头样时枪头不要碰坏凝胶壁，否不要碰坏凝胶壁，否则则DNA的的带带型将不会整型将不会整齐齐，加加样样前要用前要用枪头枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样样品空中的品空中的气泡。气泡。2）每孔最大）每孔最大DNA上上样样量确定于量确定于DNA样样品片段的大小、数目品片段的大小、数目及及样样品孔形品孔形态态与容量。与容量。3）应应留意每孔最大上留意每孔最大上样样容量及容量及样样品孔体品孔体积积，以免加，以免加样时样样时样品品流入旁流入旁边样边样品孔造成交叉品孔造成交叉污污染，影响染，影响结结果分析。果分析。4）在）在试验试验加加样样中不确定每一个中不确定每一个样样品都品都换换一个一个枪头枪头，可在阳极，可在阳极槽中反复吸打槽中反复吸打电电泳泳缓缓冲液以清洗。（冲液以清洗。（对对于于Southern印迹印迹转转移和移和须须要回收要回收DNA片段的片段的电电泳，泳，则应则应当每一个当每一个样样品用一个品用一个枪头枪头加加样样，避开，避开样样品交叉品交叉污污染。）染。）5）凝凝胶胶中中加加入入EB进进行行电电泳泳，便便于于紫紫外外线线下下视视察察电电泳泳状状态态，但但EB会会导导致致线线形形DNA迁迁移移率率下下降降，这这在在酶酶切切质质粒粒与与空空白白比照比照质质粒一起粒一起电电泳泳时应值时应值得留意。得留意。6）电电泳泳过过程程中中，溴溴化化乙乙锭锭向向负负极极移移动动，与与DNA泳泳动动的的方方向向相相反反，较较长长时时间间的的电电泳泳会会造造成成靠靠正正极极方方向向的的凝凝胶胶中中溴溴化化乙乙锭锭含含量量低低，会会对对含含量量较较少少的的小小分分子子DNA片片段段检检测测困困难难。处处理理方方法法是是：将将凝凝胶胶在在0.5ug/ml的的EB溶溶液液中中染染色色3045分分钟钟。7）推推断断正正负负极极的的另另一一方方法法是是负负极极气气泡泡（H2）比比正正极极气气泡泡（O2）多一倍。）多一倍。