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微生物遗传与育种精美课件微生物遗传与育种精美课件第第 一一 节节微生物遗传的物质基础微生物遗传的物质基础病毒重建实验病毒重建实验nH.Fraenkel-Conrat，1956n实验材料实验材料n烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（TMV）n霍氏车前花叶病毒（霍氏车前花叶病毒（HRV）n处理处理n在一定浓度的苯酚溶液中振荡，分离蛋白质外在一定浓度的苯酚溶液中振荡，分离蛋白质外壳与壳与RNA核心核心2、DNA的结构的结构nDNA的结构的结构n基本单位是脱氧核苷基本单位是脱氧核苷酸酸n反向平行、右手螺旋反向平行、右手螺旋n碱基碱基A、T、C、G有有序排列序排列n碱基之间由氢键连接碱基之间由氢键连接3、DNA的复制的复制n半保留复制半保留复制n复制起点、复制方向、复制单位复制起点、复制方向、复制单位nDNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)n复制的几种主要方式复制的几种主要方式n型复制型复制nD环复制环复制n线粒体线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制的复制形式。形式。复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象dNTPDNA-pol 3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 4、生物染色体、病毒遗传物质、生物染色体、病毒遗传物质n原核生物的染色体原核生物的染色体n核区，无核膜包裹，核区，无核膜包裹，DNA裸露，不与蛋白形成裸露，不与蛋白形成复合体复合体n染色体组成：染色体组成：DNA、RNA、蛋白质、蛋白质n往往往往只有一条只有一条染色体，大多数以染色体，大多数以双链双链、共价闭、共价闭合的合的环状环状形式存在形式存在n真核生物的染色体真核生物的染色体n核膜包裹，线性核膜包裹，线性DNA与与组蛋白组蛋白结合形成染色体结合形成染色体n染色体不止一个，每个染色体中含有染色体不止一个，每个染色体中含有1个线性个线性DNA分子分子n细胞分裂中期呈棍棒状，静止期为颗粒状细胞分裂中期呈棍棒状，静止期为颗粒状n染色体基本组成单位：核小体染色体基本组成单位：核小体n两种生物染色体两种生物染色体DNA复制区别复制区别n复制子大小、数量上差异复制子大小、数量上差异n复制起点、复制速度、方向上差异复制起点、复制速度、方向上差异第第 二二 节节微生物的基因和基因组微生物的基因和基因组Microbial Gene and Genome一、基因概念和微生物的基因结构一、基因概念和微生物的基因结构n概念概念n一段具有特定功能和结构的连续的一段具有特定功能和结构的连续的DNA片断，片断，是编码蛋白质或是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传分子遗传信息的基本遗传单位。单位。n原核生物基因的结构原核生物基因的结构n真核生物基因的结构真核生物基因的结构n一般无操纵子结构一般无操纵子结构n存在大量不编码序列和重复序列存在大量不编码序列和重复序列n转录和转译在细胞中有空间间隔转录和转译在细胞中有空间间隔n基因被许多无编码功能的基因被许多无编码功能的内含子内含子阻隔，使编码阻隔，使编码序列变成了不连续的序列变成了不连续的外显子外显子。二、基因组二、基因组n基因组（基因组（genome）n单倍体细胞中所含的全套遗传物质单倍体细胞中所含的全套遗传物质n大多数细菌和噬菌体基因组是指单个染色体大多数细菌和噬菌体基因组是指单个染色体上所含的上所含的全部基因全部基因n二倍体真核生物基因组是指单倍体细胞核内二倍体真核生物基因组是指单倍体细胞核内整套整套染色体所含的染色体所含的DNA分子及其所携带的分子及其所携带的全全部部基因基因原核生物与真核生物基因组比较原核生物与真核生物基因组比较比较项目比较项目原核生物原核生物真核生物真核生物基因组大小基因组大小小小大大复制起始点数目复制起始点数目一般一般1个个多个多个染色体数目染色体数目一般一般1个个多个多个染色体组形状染色体组形状环状环状线状线状染色体与组蛋白结合染色体与组蛋白结合无无有稳定的结合有稳定的结合核小体核小体无无有有基因连续性基因连续性强强差（被许多内含子分隔）差（被许多内含子分隔）重复序列重复序列少少多多不编码序列不编码序列少少多多操纵子结构操纵子结构普遍存在普遍存在一般没有一般没有转录、转译部位转录、转译部位同在细胞质中进行同在细胞质中进行在核中转录、在细胞质中转译在核中转录、在细胞质中转译第第 三三 节节质粒和转座子质粒和转座子Plasmid and Transposon一、质粒概述一、质粒概述n质粒（质粒（plasmid）n存在于各种微生物细胞中、独立于染色体外、存在于各种微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自主复制的遗传因子。能进行自主复制的遗传因子。n特点特点n可自我复制、稳定遗传；非必需；可转移；可可自我复制、稳定遗传；非必需；可转移；可整合；可重组；可消除整合；可重组；可消除n质粒的大小和复制质粒的大小和复制二、质粒的分子结构二、质粒的分子结构nSC构型构型nOC构型构型nL构型构型质粒的分离和鉴定质粒的分离和鉴定n分离的步骤分离的步骤n细胞培养细胞培养n细胞裂解细胞裂解n蛋白质和蛋白质和RNA的去除的去除n质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA的分离（关键步骤）的分离（关键步骤）n质粒的鉴定质粒的鉴定n电镜电镜n琼脂糖凝胶电泳确定分子量琼脂糖凝胶电泳确定分子量n聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n密度梯度离心密度梯度离心n质粒的限制性酶切图谱质粒的限制性酶切图谱三、质粒的主要类型三、质粒的主要类型n据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分类分类n致育因子（致育因子（Fertility factor，F F因子因子）n抗性因子（抗性因子（Resistance factor，R R因子因子）n产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）n毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid）n代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid）n隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）R100质粒(89kb)可使宿主对 下列药物及重金属具有抗性：汞离子（mer）磺胺(sul)链霉素(str)梭链孢酸（fus）氯霉素(cam)四环素(tet)R100质粒的遗传图谱质粒的遗传图谱四、转座子的类型和分子结构四、转座子的类型和分子结构n转座因子（转座因子（transposable element）的概念）的概念n可在可在DNA链上改变自身位置的一段链上改变自身位置的一段DNA序列。序列。n转座因子的共同特征转座因子的共同特征n插入寄主插入寄主DNA后，导致基因失活；后，导致基因失活；n转座以后，原来的转座子依然保持在原位，而在转座以后，原来的转座子依然保持在原位，而在靶序列上复制了一个转座子；靶序列上复制了一个转座子；n插入时在靶插入时在靶DNA位点产生一个短的正向重复序位点产生一个短的正向重复序列。列。n根据转座机理不根据转座机理不同分类同分类n转座子转座子n反转座子反转座子n原核生物中的转原核生物中的转座因子类型座因子类型n插入（插入（IS）序列）序列n转座子转座子(Tn)n某些温和噬菌体某些温和噬菌体n插入序列（插入序列（insertion sequence,IS）n特点特点n在在IS两端含有长为两端含有长为10-40bp反向重复序列（反向重复序列（IR）。）。n大多大多IS都含有一个都含有一个引起转座的转座酶基因。引起转座的转座酶基因。n在在IS插入时，在靶插入时，在靶DNA位点产生一个长度位点产生一个长度3-9bp正向重正向重复序列，分布在复序列，分布在IS两侧两侧。n分布在细菌染色体、质粒、某些噬菌体分布在细菌染色体、质粒、某些噬菌体DNA上上n转座子转座子(Tn)n除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因（对抗生素、某些毒物）、乳糖发酵基因等因（对抗生素、某些毒物）、乳糖发酵基因等几个至十几个基因。几个至十几个基因。nIS与与Tn有两个共同特征有两个共同特征n都携带有编码转座酶的基因，该酶为转座所必需；都携带有编码转座酶的基因，该酶为转座所必需；n两端都有反向末端重复序列，只是长度不同。两端都有反向末端重复序列，只是长度不同。nIS与与Tn主要区别主要区别nTn携带有与转座无关的抗性基因或其它特性基因携带有与转座无关的抗性基因或其它特性基因n细菌抗药性转座子的两种类型细菌抗药性转座子的两种类型n复合转座子复合转座子n由两个完全相同或类似的插入序列由两个完全相同或类似的插入序列IS和某种抗药性和某种抗药性基因组成的复合因子。基因组成的复合因子。n复杂转座子复杂转座子n两端具有两端具有IR或或DR，而不是，而不是IS，中部的编码区不仅编，中部的编码区不仅编码抗性标记，还编码转座酶和解离酶。码抗性标记，还编码转座酶和解离酶。n两个两个IR中任一个缺乏都会阻遏转座中任一个缺乏都会阻遏转座n特殊病毒（特殊病毒（Mu噬菌体）噬菌体）n与其他温和性噬菌体的差别：其基因组不论在与其他温和性噬菌体的差别：其基因组不论在进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到宿主染色体的任何位置，且游离的和已整合的宿主染色体的任何位置，且游离的和已整合的基因次序是相同的。基因次序是相同的。n没有固定的整合位置没有固定的整合位置n转座子的遗传转座子的遗传效应效应n遗传效应遗传效应n插入突变插入突变nDNA重排重排n极性效应极性效应第第 四四 节节基因突变与遗传育种基因突变与遗传育种一、基因突变一、基因突变n突变的概念突变的概念n变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传性变化。突变率常在或数量突然发生的可遗传性变化。突变率常在10-810-9范围内。范围内。n按突变涉及的范围分按突变涉及的范围分n基因突变基因突变n染色体畸变染色体畸变基因突变的类型基因突变的类型n从突变的效应来分从突变的效应来分 原序列原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly(1)同义突变同义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly(2)错义突变错义突变 5-AUG CCU UCA GGA UGU GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly(3)无义突变无义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Argn按突变所带来的表型改变分按突变所带来的表型改变分n形态突变型形态突变型 n因突变而产生的个体形态或菌落形态的变异因突变而产生的个体形态或菌落形态的变异n生化突变型生化突变型n营养缺陷型营养缺陷型n抗性突变型抗性突变型n致死突变型致死突变型n条件致死突变型条件致死突变型n突变后在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表突变后在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型突变的机制突变的机制突变突变自发突变自发突变染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位诱变诱变移码突变（缺失移码突变（缺失 添加）添加）点突变点突变碱基置换（转换碱基置换（转换 颠换）颠换）二、突变与育种二、突变与育种n自发突变与自然选育自发突变与自然选育1、自发突变的特点、自发突变的特点n自发性自发性 n突变的结果与原因之间的不对应性突变的结果与原因之间的不对应性n稀有性稀有性 10-910-6n诱变性诱变性n独立性独立性：一个基因的突变对其它基因突变物影：一个基因的突变对其它基因突变物影响，同时发生响，同时发生2个突变的几率很低。个突变的几率很低。n稳定性稳定性n可逆性可逆性2、自然选育、自然选育n目的目的n纯化与复壮菌种，保持稳定的生产性能纯化与复壮菌种，保持稳定的生产性能n步骤步骤n通过表现形态来淘汰不良菌株通过表现形态来淘汰不良菌株初筛初筛n通过目的代谢产物产量考察通过目的代谢产物产量考察复筛复筛n进行遗传基因型纯度试验进行遗传基因型纯度试验n传代稳定性试验传代稳定性试验n诱发突变与诱变育种诱发突变与诱变育种n概念概念n诱发突变诱发突变指人为地运用物理、化学或生物的方法处指人为地运用物理、化学或生物的方法处理微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变理微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变其表型的目的。其表型的目的。n诱变育种诱变育种指人为地、有意识地将对象生物置于诱变指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中，使该生物发生突变，从这些突变体中筛选因子中，使该生物发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状突变株的过程。具有优良性状突变株的过程。n常用的诱变剂常用的诱变剂n物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂n诱变处理的基本方法诱变处理的基本方法n诱变剂的选择诱变剂的选择n了解诱变剂的性质、作用机理、使用方法了解诱变剂的性质、作用机理、使用方法n充分利用复合处理的协同效应充分利用复合处理的协同效应n一次复合因子处理后需经多次分离纯化。一次复合因子处理后需经多次分离纯化。n剂量的选择剂量的选择n一般诱变效应随剂量增高而增高，达到一定剂量后，一般诱变效应随剂量增高而增高，达到一定剂量后，再增大剂量诱变率反而下降。再增大剂量诱变率反而下降。n诱变剂量确定与出发菌株特性、诱变剂性质、实际诱变剂量确定与出发菌株特性、诱变剂性质、实际效果有关。效果有关。n增效剂增效剂n影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素n出发菌株出发菌株n出发菌株的生理状态出发菌株的生理状态n细菌细菌对数生长期对数生长期n真菌、放线菌真菌、放线菌幼年孢子幼年孢子n外部环境外部环境n诱变方法诱变方法n物理诱变物理诱变n化学诱变化学诱变n合适的诱变因素剂量合适的诱变因素剂量n微生物的诱变育种的步骤和方法微生物的诱变育种的步骤和方法n优良突变菌种的筛选优良突变菌种的筛选n初筛以量为主，复筛以质为主初筛以量为主，复筛以质为主n直接摇瓶筛选法直接摇瓶筛选法n数据直观可靠，与生产接近，但工作量大数据直观可靠，与生产接近，但工作量大n一般都应进行单菌分离一般都应进行单菌分离n注意及时保藏注意及时保藏 n营养缺陷型菌株筛选营养缺陷型菌株筛选n与筛选营养缺陷型突变株有关的培养基与筛选营养缺陷型突变株有关的培养基n基本培养基（基本培养基（MM，minimal medium）“”n仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基。合培养基。n完全培养基（完全培养基（CM，complete medium）“”n满足一切营养缺陷型菌株营养需要的组合培养基。满足一切营养缺陷型菌株营养需要的组合培养基。n补充培养基（补充培养基（SM，supplemental medium）n只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。补只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。补充培养基的符号可根据加入的是充培养基的符号可根据加入的是A或或B等代谢物而分别等代谢物而分别用用A或或B等来表示。等来表示。n营养缺陷型菌株筛选方法营养缺陷型菌株筛选方法获得野生型菌株获得野生型菌株诱变剂处理诱变剂处理淘汰野生型淘汰野生型检检出营养缺陷型出营养缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型n中间培养：完全培养基或补充培养基中间培养：完全培养基或补充培养基n淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株n抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法n营养缺陷型检出营养缺陷型检出n夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印接种法接种法夹层培养法夹层培养法影印接种法影印接种法n确定生长谱确定生长谱三、基因重组和微生物育种三、基因重组和微生物育种n基因重组（基因重组（gene recombination）n两个独立基因组内的遗传基因通过一定的途径两个独立基因组内的遗传基因通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传基因组的过程。成新遗传基因组的过程。n核酸分子水平核酸分子水平上的杂交上的杂交n重组可使生物体在未发生突变的情况下，产生重组可使生物体在未发生突变的情况下，产生新遗传型的个体。新遗传型的个体。n基因重组的方式基因重组的方式n原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组 转化、转导、接合、原生质体融合转化、转导、接合、原生质体融合n真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组 有性杂交、准性杂交、原生质体融合有性杂交、准性杂交、原生质体融合原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组n转化（转化（transformation）n受体菌受体菌直接接受直接接受来自供体菌的来自供体菌的DNA片段，通片段，通过交换组合将其整合到自己基因组中，从而过交换组合将其整合到自己基因组中，从而获得供体菌某些遗传性状的现象获得供体菌某些遗传性状的现象。n转化后的受体菌称为转化后的受体菌称为转化子（转化子（transformant）n供体菌的供体菌的DNA片段称为片段称为转化因子转化因子（transforming principle）。n发生转化的条件发生转化的条件 n菌株之间的亲缘关系菌株之间的亲缘关系（受体和供体染色体的同（受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合源性，它决定转化因子的整合）n受体细胞必须处于受体细胞必须处于感受态感受态（competence）n受体细胞最易接受外源受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一片段并实现其转化的一种生理状态。种生理状态。n感受态细菌吸收感受态细菌吸收DNA的能力比一般细菌大的能力比一般细菌大1000倍倍n不论是否处于感受态，细菌都能吸附不论是否处于感受态，细菌都能吸附DNA，但只有，但只有处于感受态的细菌，吸附的处于感受态的细菌，吸附的DNA才被吸收才被吸收n不被降解（受体细胞的限制酶系统和其他核酸不被降解（受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解）酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解）转化过程转化过程n转导转导(transduction)n通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。现象。n获得新遗传性状的受体细胞称为获得新遗传性状的受体细胞称为转导子转导子（transductant）n转导的类型转导的类型n普遍转导、局限转导、溶源性转变普遍转导、局限转导、溶源性转变n普遍性转导（普遍性转导（generalized transduction）n通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段的误通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段的误包，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现包，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象象n一般以温和噬菌体作为媒介一般以温和噬菌体作为媒介完全普遍转导完全普遍转导n流产普遍性转导流产普遍性转导n经转导而获得了供体菌经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如片段的受体菌，如果外源果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，在其内既不进行交换、整合和复制，也不消失，而仅进行转录、转译和性状表达的也不消失，而仅进行转录、转译和性状表达的现象。现象。n局限转导（局限转导（specializd transduction）n通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。象。n特点特点n只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）合位点两侧的基因）n特定基因由部分缺陷型噬菌体携带特定基因由部分缺陷型噬菌体携带n低频低频“误切误切”或双重溶源菌的裂解而形成。或双重溶源菌的裂解而形成。局限性转导局限性转导普遍性转导与局限性转导的区别普遍性转导与局限性转导的区别区别要点区别要点普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导基因转导发生的时期基因转导发生的时期裂解期裂解期溶源期溶源期转导的遗传物质转导的遗传物质供体菌染色体供体菌染色体DNA任何部位或质粒任何部位或质粒噬菌体噬菌体DNA及供体及供体菌菌DNA的特定部位的特定部位转导的后果转导的后果完全转导或流产转完全转导或流产转导导受体菌获得供体菌受体菌获得供体菌DNA特定部位的遗特定部位的遗传特性传特性转导频率转导频率受体菌的受体菌的10-7转导频率较普遍转导转导频率较普遍转导增加增加1000倍倍(10-4)n溶源性转换（溶源性转换（lysogenic conversion）n当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了噬菌体的噬菌体的DNA片段，使其成为溶源状态时而致片段，使其成为溶源状态时而致细菌获得新的性状。细菌获得新的性状。n原生质体融合（原生质体融合（protopast fusion)n将两种不同的细菌经溶菌酶或青霉素等处理，将两种不同的细菌经溶菌酶或青霉素等处理，失去细胞壁成为原生质体后进行彼此融合，进失去细胞壁成为原生质体后进行彼此融合，进而发生遗传重组，以产生同时带有双亲性状、而发生遗传重组，以产生同时带有双亲性状、遗传性稳定融合子的过程。遗传性稳定融合子的过程。n标记菌株的筛选标记菌株的筛选原生质体的制备原生质体的制备原生质体的原生质体的融合融合原生质体的再生原生质体的再生融合子的选择融合子的选择优良菌优良菌种的筛选种的筛选n接合（接合（conjugation）n供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。使后者获得供体菌的遗传性状的现象。n获得新性状的受体细胞称为获得新性状的受体细胞称为接合子接合子。n接合性质粒接合性质粒n能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、质粒、R质粒、质粒、Col质粒和毒力质粒。质粒和毒力质粒。n四种相互联系的接合型菌株：四种相互联系的接合型菌株：F+菌株、菌株、F-菌株、菌株、F菌株、菌株、Hfr菌株菌株F+F-F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientF F-FFFFFF-FF-HfrF+F+HfrHfr F-HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组n有性杂交有性杂交n一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。n准性杂交准性杂交n同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。重组子的杂交方式。有性生殖与准性生殖的比较有性生殖与准性生殖的比较项项 目目准性生殖准性生殖有性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态相同的体细胞形态或生理有分化的性细胞形态或生理有分化的性细胞独立生活的异核体阶段独立生活的异核体阶段有有无无接合后双倍体的细胞形态接合后双倍体的细胞形态与单倍体基本相同与单倍体基本相同与单倍体明显不同与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径双倍体变为单倍体的途径通过有丝分裂通过有丝分裂通过减数分裂通过减数分裂接合发生的几率接合发生的几率偶尔发现，几率低偶尔发现，几率低正常出现，几率高正常出现，几率高第第 五五 节节微生物基因工程微生物基因工程n基因工程概念基因工程概念n基因水平上的遗传工程基因水平上的遗传工程n将某一生物体的遗传信息将某一生物体的遗传信息在细胞外在细胞外与载体相连与载体相连接，构建成一个新的重组接，构建成一个新的重组DNA分子，然后将其分子，然后将其转入另一些生物体细胞中，使引入的供体转入另一些生物体细胞中，使引入的供体DNA片段成为受体遗传物质的一部分，其所带的遗片段成为受体遗传物质的一部分，其所带的遗传信息得以表达或创建出一个新物种。传信息得以表达或创建出一个新物种。n特点特点n体外重组、远缘杂交、定向性体外重组、远缘杂交、定向性基基因因工工程程的的主主要要步步骤骤n从供体细胞的从供体细胞的DNA中分离中分离n限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切n特异性特异性DNA片段的片段的PCR扩增扩增n以以DNA一条链为模板，在多聚酶催化下，通过碱基配一条链为模板，在多聚酶催化下，通过碱基配对使寡核苷酸引物向对使寡核苷酸引物向3方向延方向延长合成模板的互合成模板的互补链。n整个整个过程分三步：程分三步：变性、退火、延伸性、退火、延伸nPCR引物是引物是PCR过程中与模板程中与模板DNA部分序列互部分序列互补，并，并能引能引导模板模板DNA互互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，其其3端必端必须具有游离的具有游离的OH基基团。目的基因分离的途径目的基因分离的途径n构建构建cDNA文库和基因组文库分离目的基因文库和基因组文库分离目的基因ncDNA 文库（文库（cDNA library）n某生物所转录的某生物所转录的全部全部 mRNA 经反转录形成的经反转录形成的 cDNA 片段，再复制成双链片段，再复制成双链cDNA，与合适的克隆载体连接，与合适的克隆载体连接，通过转导（转化）转入受体菌，这种包含某生物基因通过转导（转化）转入受体菌，这种包含某生物基因组全部基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为。的受体菌群体称为。n基因文库（基因文库（genomic DNA library）n存在于转化细菌中、由克隆载体所携带的存在于转化细菌中、由克隆载体所携带的所有基因组所有基因组DNA的集合。的集合。n涵盖基因组的全部基因信息涵盖基因组的全部基因信息n主要用于真核微生物、动植物中特定基因的克隆主要用于真核微生物、动植物中特定基因的克隆n由化学方法合成特定功能的基因由化学方法合成特定功能的基因nDNA合成仪合成仪，根据待合成的，根据待合成的DNA片段预定的核片段预定的核苷酸序列，可自动地将苷酸序列，可自动地将4种核苷酸单体按种核苷酸单体按 35磷磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。酸酯键连接成寡核苷酸片段。n主要用于结构简单、核苷酸顺序清楚的基因克隆主要用于结构简单、核苷酸顺序清楚的基因克隆n目前常用此方法合成引物、寡核苷酸连杆以及基目前常用此方法合成引物、寡核苷酸连杆以及基因片段等。因片段等。目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n受体细胞受体细胞n原核生物细胞如大肠杆菌、蓝藻等原核生物细胞如大肠杆菌、蓝藻等n酵母菌、动植物细胞酵母菌、动植物细胞n载体载体n载体种类载体种类n质粒载体质粒载体n噬菌体载体噬菌体载体n根据特殊要求构建的载体根据特殊要求构建的载体n载体必须具备的几个条件载体必须具备的几个条件n必须是一个复制子，不宜过大；必须是一个复制子，不宜过大；n在受体细胞中有较高的复制率，能稳定遗传；在受体细胞中有较高的复制率，能稳定遗传；n最好只有一个限制性内切酶切口，使目的基因最好只有一个限制性内切酶切口，使目的基因能固定的整合到载体能固定的整合到载体DNA的一定位置上；的一定位置上；n载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数把极少数“工程菌工程菌”或或“工程细胞工程细胞”选择出来选择出来n目的基因组入克隆载体目的基因组入克隆载体n克隆载体的选择克隆载体的选择n目的基因与载体目的基因与载体DNA体外重组体外重组n限制性内切酶处理或人为地连接粘性末端限制性内切酶处理或人为地连接粘性末端n低温（低温（56）混合）混合“退火退火”由于每一种限制性内切酶所切断的双链由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘片段的粘性末端有相同的核苷酸组分，所以二者相混，凡粘性末端有相同的核苷酸组分，所以二者相混，凡粘性末端上碱基互补的片段通过氢键形成双链性末端上碱基互补的片段通过氢键形成双链n连接酶使目的基因与载体连接酶使目的基因与载体DNA连接连接n形成重组载体形成重组载体n重组重组DNA分子导入原核生物细胞分子导入原核生物细胞n转化、转导、三亲本杂交转化转化、转导、三亲本杂交转化n克隆子的筛选克隆子的筛选n利用抗菌素抗性基因进行筛选利用抗菌素抗性基因进行筛选n利用乳糖操纵子利用乳糖操纵子lacZ基因筛选基因筛选n利用双酶切片断重组法初筛利用双酶切片断重组法初筛n利用报告基因筛选克隆子利用报告基因筛选克隆子 n克隆子的鉴定克隆子的鉴定n限制性酶切法、分子杂交法、限制性酶切法、分子杂交法、DNA测序法、目测序法、目的基因转录产物检测、目的基因翻译产物检测的基因转录产物检测、目的基因翻译产物检测第第 六六 节节微生物菌种保藏及复壮微生物菌种保藏及复壮一、微生物菌种保藏一、微生物菌种保藏 n微生物菌种保藏目的微生物菌种保藏目的n妥善保藏使菌不死、不衰、不乱，便于交换使用和研究。妥善保藏使菌不死、不衰、不乱，便于交换使用和研究。n原则是尽量降低菌种的代谢活动，隔绝外界影响。原则是尽量降低菌种的代谢活动，隔绝外界影响。n原理原理n选典型优良纯种，最好用休眠体选典型优良纯种，最好用休眠体，如分生孢子、芽孢等。，如分生孢子、芽孢等。n创造一适合其长期休眠的环境条件创造一适合其长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺，如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，使微生物生长受抑制，代谢不氧、避光、缺乏营养等，使微生物生长受抑制，代谢不活泼。活泼。n选择菌种保藏方法要考虑的因素选择菌种保藏方法要考虑的因素n保持原菌优良性状不变；保持原菌优良性状不变；n方法通用，操作简便，设备普及。方法通用，操作简便，设备普及。n注意：注意：n传代菌种每传代菌种每一株菌最好保持培养两个以上一株菌最好保持培养两个以上；n温度温度：比正常偏低；：比正常偏低；n接种间隔时间接种间隔时间：与培养基自身水分、温度、湿：与培养基自身水分、温度、湿度有关；传代不宜过于频繁，短则易变异，长度有关；传代不宜过于频繁，短则易变异，长则易死亡。则易死亡。常用菌种保藏方法比较常用菌种保藏方法比较方法方法原理原理适用性适用性保藏期保藏期评价评价斜面冰箱保藏斜面冰箱保藏低温低温4左右左右各大类微生物各大类微生物36月月简便简便半固体冰箱保半固体冰箱保藏藏低温低温细菌，酵母菌细菌，酵母菌612月月简便简便石蜡油封藏石蜡油封藏低温缺氧低温缺氧各大类微生物各大类微生物(除除石油发酵菌石油发酵菌)12年年简便简便沙土管保藏沙土管保藏干燥无氧无营养干燥无氧无营养产孢子、芽孢的产孢子、芽孢的微生物微生物110年年简便有效简便有效冷冻干燥保藏冷冻干燥保藏干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、保护剂温、保护剂各大类微生物各大类微生物515年以年以上上繁而有效繁而有效液氮保藏液氮保藏低温低温150196，保护剂，保护剂各大类微生物各大类微生物20年以上年以上简便有效简便有效二、菌种的衰退与复壮二、菌种的衰退与复壮 n菌种的衰退菌种的衰退n由于自发突变导致某物种原有一系列生物学性由于自发突变导致某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。状发生量变或质变的现象。n菌种退化的原因菌种退化的原因n有关基因的负突变有关基因的负突变n菌种衰退的表现菌种衰退的表现n形态性状变得不典型形态性状变得不典型n生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产孢子越来越少n代谢产物生产能力下降代谢产物生产能力下降n对宿主寄生能力下降对宿主寄生能力下降n抗不良环境条件能力减弱抗不良环境条件能力减弱n防止菌种衰退的措施防止菌种衰退的措施n合理育种；合理育种；n选择合适的培养基；选择合适的培养基；n创造良好的培养条件；创造良好的培养条件；n控制传代次数；控制传代次数；n利用不同类型的细胞进行接种传代，如放线菌利用不同类型的细胞进行接种传代，如放线菌和霉菌用其孢子传代比用菌丝传好；和霉菌用其孢子传代比用菌丝传好；n采用有效的菌种保藏法。采用有效的菌种保藏法。n菌种的复壮菌种的复壮n狭义的复壮狭义的复壮仅是一消极措施，是指在菌种发生仅是一消极措施，是指在菌种发生衰退时，通过纯种分离和测定生产性能等方法，衰退时，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；n广义的复壮广义的复壮则是一积极的措施，即在菌种的生则是一积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识的进行纯种分离产性能尚未衰退前经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。即利用正变选种。逐步有所提高。即利用正变选种。n菌种复壮的方法菌种复壮的方法n纯种分离纯种分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离菌丝尖端切割法进行单细胞分离显微操纵器进行单细胞分离显微操纵器进行单细胞分离分离小室进行单细胞分离分离小室进行单细胞分离细胞纯的分离方法细胞纯的分离方法琼脂培养基浇注法琼脂培养基浇注法平板划线分离法平板划线分离法平板表面涂布法平板表面涂布法菌落纯的分离方法菌落纯的分离方法n淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体n通过物理，化学方法处理菌体或孢子，使死通过物理，化学方法处理菌体或孢子，使死亡率达亡率达80%以上，留下菌株多为较健壮，从以上，留下菌株多为较健壮，从中选优良菌种。如：乳酸菌用提高中选优良菌种。如：乳酸菌用提高pH值或低值或低温处理温处理复壮。复壮。n通过宿主体内生长复壮通过宿主体内生长复壮 复壮前，应分析判断清衰退、饰变、污复壮前，应分析判断清衰退、饰变、污染，对症下药染，对症下药