噬菌体效价的测定在菌苔上逐步形成的噬菌体群体由于其.ppt

噬菌体效价的测定在菌苔上逐步形成的噬菌体群体由于其 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 由于试祥中一般噬菌体粒子含量较高，故应先对由于试祥中一般噬菌体粒子含量较高，故应先对试样进行梯级稀释，然后再选用合适的方法（见以下试样进行梯级稀释，然后再选用合适的方法（见以下表解表解)测定其效价。测定其效价。（1）双层平板法）双层平板法 是一种被普遍采用并能精确测定效价的方法。预先分别配制是一种被普遍采用并能精确测定效价的方法。预先分别配制含含2%和和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用前者在培养琼脂的底层培养基和上层培养基。先用前者在培养皿上浇一层平板，再在后者皿上浇一层平板，再在后者(须先融化并冷却到须先融化并冷却到45以下以下)中加入中加入较浓的对数期敏感菌和一定体积的待测噬菌体样品，于试管中较浓的对数期敏感菌和一定体积的待测噬菌体样品，于试管中充分混匀后，立即倒在底层平板上铺平待凝，然后保温。一般充分混匀后，立即倒在底层平板上铺平待凝，然后保温。一般经十余小时后即可进行噬菌斑计数。现把双层平板法简括如下经十余小时后即可进行噬菌斑计数。现把双层平板法简括如下:双层平板法主要有以下几个优点；双层平板法主要有以下几个优点；加了底层培加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；补；所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象致发生上下噬菌斑的重叠现象(下图下图)；因上层培养因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。（2）单层平板法）单层平板法 在上述双层平板中省略底层，但所用培养基的浓度在上述双层平板中省略底层，但所用培养基的浓度和所加的量均比双层平板法的上层为高和多。此法虽和所加的量均比双层平板法的上层为高和多。此法虽较简便，但其实验效果较差。较简便，但其实验效果较差。（3）玻片快速法）玻片快速法 将噬菌体和敏感的宿主细胞与适量的琼脂培养基将噬菌体和敏感的宿主细胞与适量的琼脂培养基(0.50.8%琼脂，事前融化琼脂，事前融化)充分混合。涂布在无菌载玻充分混合。涂布在无菌载玻片上，经短期培养后，即可在低倍显微镜或放大镜下片上，经短期培养后，即可在低倍显微镜或放大镜下计数。例如，用于金黄色葡萄球菌噬菌体的效价测定，计数。例如，用于金黄色葡萄球菌噬菌体的效价测定，仅需仅需2.54.0小时即可，唯精确度较差。小时即可，唯精确度较差。(4)斑点试验法斑点试验法 这是一种半定量的预试验方法。先将敏感的宿主菌浓这是一种半定量的预试验方法。先将敏感的宿主菌浓悬液涂布于合适的培养基平板上，然后使平板表面朝下，悬液涂布于合适的培养基平板上，然后使平板表面朝下，在在45左右的温箱中使平板表面不留水膜。再把不同稀释左右的温箱中使平板表面不留水膜。再把不同稀释度待测试样依次用接种环点种在上述平板上。保温数小时度待测试样依次用接种环点种在上述平板上。保温数小时后，根据点样处是否产生噬菌斑即可初步判断该试样的效后，根据点样处是否产生噬菌斑即可初步判断该试样的效价。价。(5)液体稀释管法液体稀释管法 与用于细菌活菌计数中的系列稀释法相似。不同处是：与用于细菌活菌计数中的系列稀释法相似。不同处是：各试管中均加有培养液；各试管中均加有培养液；各管中均须接入处于对数期各管中均须接入处于对数期的宿主细胞；的宿主细胞；以不长菌的最高稀释管来计算效价。以不长菌的最高稀释管来计算效价。成斑率成斑率 3.一步生长曲线一步生长曲线 一步生长曲线：定一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称为一规律的实验曲线称为一步生长曲线。步生长曲线。潜伏期，潜伏期，裂解期，平稳期。裂解期，平稳期。效效价价(1)潜伏期潜伏期 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子装配前的一段时间，故整段潜伏期中没有一个成熟的噬菌装配前的一段时间，故整段潜伏期中没有一个成熟的噬菌体粒子从细胞中释放出来。潜伏期又可分两段：体粒子从细胞中释放出来。潜伏期又可分两段：隐晦期隐晦期(eclipse phase），指在潜伏期前期人为地），指在潜伏期前期人为地(用氯仿用氯仿)裂解细胞，裂解细胞，裂解液仍无侵染性的一段时间。裂解液仍无侵染性的一段时间。胞内累积期胞内累积期(intracellular accumulation phase)，又称潜伏后期。指在，又称潜伏后期。指在隐晦期后，如人为地裂解细胞，其裂解液已出现侵染性的隐晦期后，如人为地裂解细胞，其裂解液已出现侵染性的一段时间。这是菌体开始装配的时期，在电镜下可观察到一段时间。这是菌体开始装配的时期，在电镜下可观察到己初步装配好的噬菌体粒子。己初步装配好的噬菌体粒子。(2)裂解期裂解期 紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、溶液中噬紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。噬菌体或其他病毒因没有菌体粒子急剧增多的一段时间。噬菌体或其他病毒因没有个体生长，只有个体装配再加上其宿主细胞裂解的突发性，个体生长，只有个体装配再加上其宿主细胞裂解的突发性，因此，从理论上来分析，裂解期应是瞬时的。但事实上因因此，从理论上来分析，裂解期应是瞬时的。但事实上因为细菌群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故实际上为细菌群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故实际上的裂解期还是较长的（见图）。的裂解期还是较长的（见图）。(3)平稳期平稳期(plateau)指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点后的时期。最高点后的时期。一步生长曲线实验最早由一步生长曲线实验最早由Ellis和和Delbruck(1939)所设计。其所设计。其基本步骤是：用噬菌体的稀悬液去感染高浓度的宿主细胞，以基本步骤是：用噬菌体的稀悬液去感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞至多不超过一个噬菌体吸附。经数分钟吸附后，保证每个细胞至多不超过一个噬菌体吸附。经数分钟吸附后，混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清，借以中和尚未吸附混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清，借以中和尚未吸附的噬菌体。然后用保温的培养液稀释此混合液，同时可中止抗的噬菌体。然后用保温的培养液稀释此混合液，同时可中止抗血清的作用。随即置于该细菌最适生长温度下培养。在一定的血清的作用。随即置于该细菌最适生长温度下培养。在一定的时间内，每隔数分钟从混合悬液中取出一份试样，并作效价测时间内，每隔数分钟从混合悬液中取出一份试样，并作效价测定。定。4.溶源性溶源性（1）温和噬菌体温和噬菌体 吸附并侵入宿主细胞后，噬菌体的吸附并侵入宿主细胞后，噬菌体的DNA只整合在宿主的基因组上，并可长期随宿主只整合在宿主的基因组上，并可长期随宿主DNA的的复制而进行同步复制，因而在一般情况下不进行增殖和引复制而进行同步复制，因而在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解的噬菌体，称起宿主细胞裂解的噬菌体，称温和噬菌体温和噬菌体(temperate phage)或溶源噬菌体（或溶源噬菌体（lysogenic phage)。这种温和噬菌体。这种温和噬菌体侵入宿主细胞而不引起宿主细胞裂解，即称侵入宿主细胞而不引起宿主细胞裂解，即称溶源性溶源性或溶源或溶源现象。其宿主细胞称为现象。其宿主细胞称为溶原菌溶原菌。概括地说，温和噬菌体的特点为：概括地说，温和噬菌体的特点为：具有整合能力，当温和噬菌体侵入其敏感宿主的细胞具有整合能力，当温和噬菌体侵入其敏感宿主的细胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因组后，前者的核酸可整合到后者的核基因组(genome，即，即核染色体核染色体)上，这种处于整合态的噬菌体核酸，称作上，这种处于整合态的噬菌体核酸，称作前噬前噬菌体菌体(prophage）；）；具有同步复制能力，前噬菌体在一般情况下不进行复具有同步复制能力，前噬菌体在一般情况下不进行复制和增殖，制和增殖，而是随宿主细胞的核基因组的复制而同步复而是随宿主细胞的核基因组的复制而同步复制，并平均分布到两个子代细胞中去，如此代代相传。制，并平均分布到两个子代细胞中去，如此代代相传。由此可见，温和噬菌体的存在形式有三种：由此可见，温和噬菌体的存在形式有三种：游离态游离态：指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子；：指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子；整合态整合态：指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态：指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态（一种潜伏的形式）（一种潜伏的形式）营养态营养态：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制和装配的状态。基因组而处于积极复制和装配的状态。温和噬菌体的种类很多，常见的有温和噬菌体的种类很多，常见的有E.coli的的 Mu-1、P-1和和P-2噬菌体等。其中，噬菌体等。其中，噬菌体是研究最为透彻的一种温和噬噬菌体是研究最为透彻的一种温和噬菌体。菌体。E.coli K12():表示一株带有前噬菌体的大肠杆菌的K12溶源菌株。（2）溶源菌溶源菌(1ysogen或或lysogenic bacteria)溶源菌有以下几个特性：溶源菌有以下几个特性：自发裂解自发裂解，在溶源菌的分裂过程中，会有，在溶源菌的分裂过程中，会有10-210-5个细胞发生个细胞发生自发裂解自发裂解(spontaneous lysis），其原因是由于少数细胞中原来处），其原因是由于少数细胞中原来处于整合态的前噬菌体转变成营养态的裂解性噬菌体于整合态的前噬菌体转变成营养态的裂解性噬菌体(lytic phage)之故；之故；复愈复愈，在溶源性细菌群体的增殖过程中，一般有，在溶源性细菌群体的增殖过程中，一般有10-5的个体丧的个体丧失其前噬菌体，并成为非溶源性的细菌，这一过程称为复愈或失其前噬菌体，并成为非溶源性的细菌，这一过程称为复愈或非溶源化，复愈后的细胞其免疫性也随之丧失；非溶源化，复愈后的细胞其免疫性也随之丧失；还有其他特征，以后的章节将有陆续介绍。在自然界中各还有其他特征，以后的章节将有陆续介绍。在自然界中各种细菌、放线菌等都有溶源菌存在。种细菌、放线菌等都有溶源菌存在。检验溶源菌的方法是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌（遇溶源检验溶源菌的方法是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生活周期者）相混合，菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生活周期者）相混合，然后与琼脂培养基混匀后倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌然后与琼脂培养基混匀后倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，所以会产生放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，所以会产生一个个中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。一个个中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。（二）植物病毒（二）植物病毒1、大多为、大多为ssRNA病毒。病毒。2、基本形态为杆状、丝状、球状。、基本形态为杆状、丝状、球状。3、对宿主的专一性较差，如、对宿主的专一性较差，如TMV等。等。4、引起植物病害症状：破坏植物的叶绿体或叶绿素，、引起植物病害症状：破坏植物的叶绿体或叶绿素，是植是植 物叶片发生黄化、红化或发生花叶；使植物物叶片发生黄化、红化或发生花叶；使植物发生矮化、丛枝或畸形；形成枯斑或坏死。发生矮化、丛枝或畸形；形成枯斑或坏死。5、增值中的侵入是被动方式。、增值中的侵入是被动方式。6、已知植物病毒有、已知植物病毒有700多种（多种（1989）。）。（三）人类和脊椎动物病毒（三）人类和脊椎动物病毒1、核酸类型很多，、核酸类型很多，dsDNA，ssDNA，dsRNA，ssRNA。2、一般呈球状。、一般呈球状。3、种类：、种类：300+9004、常见的人病毒、常见的人病毒 引起的疾病：感冒、肝炎、疱疹、引起的疾病：感冒、肝炎、疱疹、流行性乙型脑炎、狂犬病以及艾滋病等。动物疾病：流行性乙型脑炎、狂犬病以及艾滋病等。动物疾病：猪瘟、牛瘟、口蹄疫、鸡瘟等。猪瘟、牛瘟、口蹄疫、鸡瘟等。（四）昆虫病毒（四）昆虫病毒1、1671种（种（1990）。）。2、可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，、可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称为多角体（称为多角体（polyhedron）。其成分为碱性结晶蛋白，）。其成分为碱性结晶蛋白，其内包裹着数目不等的病毒粒。多角体功能是保护其内包裹着数目不等的病毒粒。多角体功能是保护病毒粒免受外界不良环境的破坏。病毒粒免受外界不良环境的破坏。3、昆虫病毒种类主要有、昆虫病毒种类主要有3种：种：核型多角体病毒；核型多角体病毒；质型多角体病毒；质型多角体病毒；颗粒体病毒。颗粒体病毒。