第六章-光学检测技术-张静优秀PPT.ppt

第一节第一节 旋光检测技术旋光检测技术利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。技术。旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度。左旋（），右旋（）。光度。左旋（），右旋（）。物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有亲密关系。溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有亲密关系。旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质的旋光度以确定其含量的分析方法。的旋光度以确定其含量的分析方法。旋光度和比旋光度是旋光性物质的旋光度和比旋光度是旋光性物质的主要物理性质。通过旋光度和比旋主要物理性质。通过旋光度和比旋光度的测定，可以检查光学活性化光度的测定，可以检查光学活性化合物的合物的纯度纯度，也可以定量分析有关，也可以定量分析有关化合物溶液的化合物溶液的浓度浓度。光是一种电磁波，即光波的振动方向与其前进方向相互垂直。自光是一种电磁波，即光波的振动方向与其前进方向相互垂直。自然光有多数个与光的前进方向相互垂直的光波振动面。若光线前进的然光有多数个与光的前进方向相互垂直的光波振动面。若光线前进的方向指向我们，则与之相互垂直的光波振动平面可表示为如图（方向指向我们，则与之相互垂直的光波振动平面可表示为如图（a），），图中箭头表示光波振动的方向。若使自然光通过尼科尔棱镜，由于振图中箭头表示光波振动的方向。若使自然光通过尼科尔棱镜，由于振动面与尼科尔棱镜的光轴平行的光波才能通过尼科尔棱镜，所以通过动面与尼科尔棱镜的光轴平行的光波才能通过尼科尔棱镜，所以通过尼科尔棱镜的光，只有一个与光的前进方向相互垂直的光波振动面，尼科尔棱镜的光，只有一个与光的前进方向相互垂直的光波振动面，如图（如图（b）。这种仅在一个平面上振动的光叫偏振光。）。这种仅在一个平面上振动的光叫偏振光。自然光与偏振光自然光与偏振光 通常用以下两种方法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片。通常用以下两种方法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片。尼尼科科尔尔棱棱镜镜 一一块块方方解解石石的的菱菱形形六六面面体体末末端端的的表表面面磨磨光光，使使镜镜角角等等于于68，将将之之对对角角切切成成两两半半，把把切切面面磨磨成成光光学学平平面面后后，再再用用加加拿拿大大树树胶胶粘粘起起来来，便便成成为为一一个个尼尼科科尔尔棱棱镜镜。其其中中特特别别光光线线MP由由方方解解石石到到加加拿拿大大树树胶胶是是由由光光疏疏介介质质到到光光密密介介质质，必必将将发发生生折折射射通通过过加加拿拿大大树树胶胶，由由棱棱镜镜的的另另一一端端面面射射出出，从从而而产产生生了了平平面面偏偏振振光。光。偏振光的产生偏振光的产生尼科尔棱镜示意图尼科尔棱镜示意图偏振片偏振片 利用偏振片也能产生偏振光。它是利利用偏振片也能产生偏振光。它是利用某些双折射晶体（如电气石）的二色性，即用某些双折射晶体（如电气石）的二色性，即可选择性吸取寻常光线，而让特别光线通过的可选择性吸取寻常光线，而让特别光线通过的特性，把自然光变成偏振光。特性，把自然光变成偏振光。分分子子结结构构中中有有不不对对称称碳碳原原子子，能能把把偏偏振振光光的的偏偏振振面面旋旋转转确确定定角角度度的的物物质质称称为为光光学学活活性性物物质质。很很多多食食品品成成分分都都具具有有光光学学活活性性，如如单单糖糖、低低聚聚糖糖、淀淀粉粉以以及及大大多多数数的的氨氨基基酸酸和和羟羟酸酸等等。其其中中能能把把偏偏振振光光的的振振动动平平面面对对右右旋旋转转的的，称称为为“具具有有右右旋旋性性”，以以（十十）号号表表示示；反反之之称为称为“具有左旋性具有左旋性”，以（一）号表示。，以（一）号表示。旋光性、旋光性物质旋光性、旋光性物质旋光度旋光度 偏偏振振光光通通过过光光学学活活性性物物质质的的溶溶液液时时，其其振振动动平平面面所所旋旋转转的的角角度度叫叫做做该该物物质质溶溶液液的的旋旋光光度度，以以表表示示。旋旋光光度度的的大大小小与与光光源源的的波波长长、温温度度、旋旋光光性性物物质质的的种种类类、溶溶液液的的浓浓度度及及液液层层的的厚厚度度有有关关。对对于于特特定定的的光光学学活活性性物物质质，在在光光源源波波长长和和温温度度确确定定的的状状况况下下，其其旋旋光光度度与与溶溶液液的的浓浓度度c和液层的厚度和液层的厚度L成正比。成正比。即：即：KcL比旋光度比旋光度 当当旋旋光光性性物物质质的的浓浓度度为为 100 g/100 ml，液液层层厚厚度度为为 l dm（分分米米）时时所所测测得得的的旋旋光光度度称称为为比比旋旋光光度度，以以 表表示示。由由上式可知：上式可知：K11K 即：即：式中：式中：比旋光度，度；比旋光度，度；t 温度，温度，光源波长，光源波长，nm；旋光度，度；旋光度，度；L液层厚度或旋光管长度，液层厚度或旋光管长度，dm；c溶液浓度，溶液浓度，gml。比旋光度与光的波长及测定温度有关。比旋光度与光的波长及测定温度有关。通常规定用钠光通常规定用钠光D线（波长线（波长 589.3nm）在）在20时测定，在此条件下，比旋光度用时测定，在此条件下，比旋光度用 表示表示 因在确定条件下比旋光度因在确定条件下比旋光度 是已知的，是已知的，L为确定，故测得了旋光度就可计算出旋光为确定，故测得了旋光度就可计算出旋光质溶液中的浓度质溶液中的浓度c。变旋作用变旋作用定义定义 具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖，具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖，果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初快速变更，然后渐渐变得较缓慢，旋光度起初快速变更，然后渐渐变得较缓慢，最终达到恒定值，这种现象称为变旋作用。最终达到恒定值，这种现象称为变旋作用。这这是是由由于于有有的的糖糖存存在在两两种种异异构构体体，即即型型和和型型，它它们们的的比比旋旋光光度度不不同同。这这两两种种环环型型结结构构及及中中间间的的开开链链结结构构在在构构成成一一个个平平衡衡体体系系过过程程中中，即即显显示示出出变变旋旋光光作作用。用。变旋现象变旋现象 因此，在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有还原糖的因此，在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有还原糖的样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜再测定。若需马上测定，样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜再测定。若需马上测定，可将中性溶液（可将中性溶液（pH=7）加热至沸，或加几滴氨水后再稀释定）加热至沸，或加几滴氨水后再稀释定容；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚容；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚显碱性。在碱性溶液中，变旋光作用快速，很快达到平衡。但显碱性。在碱性溶液中，变旋光作用快速，很快达到平衡。但微碱性溶液不宜放置过久，温度也不行太高，以免破坏样品。微碱性溶液不宜放置过久，温度也不行太高，以免破坏样品。旋光仪旋光仪WXG型半荫旋光仪型半荫旋光仪检糖计检糖计WZB自动旋光仪自动旋光仪WGX型半荫旋光仪型半荫旋光仪结构和原理结构和原理 起偏棱镜一般用尼科尔（起偏棱镜一般用尼科尔（Nicol)棱镜，以棱镜，以获得偏振光。获得偏振光。旋光管盛装待测液的玻璃管。旋光管盛装待测液的玻璃管。检偏棱镜仍用尼科尔（检偏棱镜仍用尼科尔（Nicol)棱镜，用以棱镜，用以检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相比较的角度（可由刻度盘上的数值读出）。比较的角度（可由刻度盘上的数值读出）。检糖计检糖计 检糖计专用于糖类的测定。检糖计专用于糖类的测定。故刻度数值干脆表示为蔗糖的故刻度数值干脆表示为蔗糖的百分含量（百分含量（W/V），其测定原），其测定原理与旋光计相同。在结构上有理与旋光计相同。在结构上有以下特点以下特点 检糖计的基本光学元件检糖计的基本光学元件自动旋光仪自动旋光仪当检测池中放进存有被测溶液的试管后，当检测池中放进存有被测溶液的试管后，由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转了一个角度，零度视场便发生了变更，转了一个角度，零度视场便发生了变更，转动检偏镜确定角度，能再次出现亮度一样动检偏镜确定角度，能再次出现亮度一样的视场。这个转角就是溶液的旋光度，测的视场。这个转角就是溶液的旋光度，测得溶液的旋光度后，就可以求出物质的比得溶液的旋光度后，就可以求出物质的比旋度。依据比旋度的大小，就能确定该物旋度。依据比旋度的大小，就能确定该物质的纯度和含量了。质的纯度和含量了。旋光法测定味精浓度旋光法测定味精浓度样品溶液配制样品溶液配制精确称取味精样品精确称取味精样品10.00g，加，加4050mL蒸馏水蒸馏水溶解，搅拌加入分析纯盐酸溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精全部，使味精全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。旋光仪调零旋光仪调零预热预热10min，放进滤光片。取，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸分析纯盐酸蒸馏水定容至蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。装满旋光管，调整零点。样品液测定样品液测定样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，测定旋光度，记录温度。测定旋光度，记录温度。物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状态，因此，它必需释放多余的能量，变成稳定状态，因此，它必需释放多余的能量，变成稳定状态的分子。态的分子。分子发光：由激发态能级回到基态能级的过程分子发光：由激发态能级回到基态能级的过程中以光的形式释放多余的能量，并放射出比原波中以光的形式释放多余的能量，并放射出比原波长更长的光谱。长更长的光谱。荧光分光光度法：检测分子放射光谱的分析方荧光分光光度法：检测分子放射光谱的分析方法。法。其次节其次节 荧光检测技术荧光检测技术一、特点一、特点 专一性强专一性强灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸取光谱灵敏度高取光谱灵敏度高24个数量级左右。个数量级左右。选择性强：既可分析放射光谱，也可分析激发光选择性强：既可分析放射光谱，也可分析激发光谱，偏振光谱。谱，偏振光谱。发光方式多：物理发光，化学发光，生物发光。发光方式多：物理发光，化学发光，生物发光。可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命等多种物理参数。光效率，荧光寿命等多种物理参数。二、方法原理二、方法原理荧光现象：是一种发光现象，当一种波长的荧光现象：是一种发光现象，当一种波长的光照射在某一荧光物质时，该物质被激发光照射在某一荧光物质时，该物质被激发,若能在极短的时间内放射出较激发波长更长若能在极短的时间内放射出较激发波长更长波长的光波长的光,在激发态停留的时间大约在激发态停留的时间大约10-810-4s.放射的光谱称为荧光光谱放射的光谱称为荧光光谱.磷光光谱磷光光谱:若这种光在激发态停留较长的时若这种光在激发态停留较长的时间间,即在激发态停留的时间大约是即在激发态停留的时间大约是10-410s,系统内放射出比荧光波长更长波长的光系统内放射出比荧光波长更长波长的光.放放射的光谱称为磷光光谱射的光谱称为磷光光谱.1.荧光产朝气理荧光产朝气理2.（1）分子能级：最低第一级电）分子能级：最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的子激发态振动能级是产生荧光的基础。分子吸取能量后，电子跃基础。分子吸取能量后，电子跃迁到哪一个能级并不重要，重要迁到哪一个能级并不重要，重要的是吸取了能量的分子经过内转的是吸取了能量的分子经过内转移以后，将能量降到最低第一级移以后，将能量降到最低第一级电子激发态振动能级后，能否以电子激发态振动能级后，能否以光子的形式释放能量，如能就会光子的形式释放能量，如能就会放射荧光，否则不会。放射荧光，否则不会。（2）耗能方式）耗能方式:产生荧光产生荧光:分子内在因素和外在条件确定分子内在因素和外在条件确定.在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量;无辐射衰减转给四周分子变成振动能消耗无辐射衰减转给四周分子变成振动能消耗;辐射荧光辐射荧光-以光子的形式释放能量以光子的形式释放能量;光分解消耗分子内部的能量光分解消耗分子内部的能量(光分解以产生光分解以产生热的方式，使物质结构发生变更，发光热的方式，使物质结构发生变更，发光基团的发光能量减弱或丢失基团的发光能量减弱或丢失).（3）能量的传递途径）能量的传递途径:处于较高能级的激发处于较高能级的激发态电子回到基态途径态电子回到基态途径当两个电子能级特别靠近当两个电子能级特别靠近以致其振动能级发生重叠以致其振动能级发生重叠时，电子由高能级以无辐时，电子由高能级以无辐射跃迁方式转移给低能级射跃迁方式转移给低能级不同多重态间的无辐射跃迁，不同多重态间的无辐射跃迁，如如S1T1。有时通过热激发，。有时通过热激发，就有可能发生就有可能发生T1 S1，然，然后产生延迟荧光后产生延迟荧光被激发分子与溶剂分子或其他被激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用把多余的溶质分子的相互作用把多余的能量转移给四周分子，使荧光能量转移给四周分子，使荧光或磷光放射的强度减弱或消逝。或磷光放射的强度减弱或消逝。也称荧光熄灭或猝灭也称荧光熄灭或猝灭激发态分子把多余的振动激发态分子把多余的振动能量以热的形式转给四周能量以热的形式转给四周分子，而自身从分子，而自身从Sn的较高的较高振动能级层降低到该电子振动能级层降低到该电子能级的最低振动能级层上能级的最低振动能级层上处于第一激发单重态最低处于第一激发单重态最低振动能级的电子回到基态振动能级的电子回到基态振动能级时，在短时间内振动能级时，在短时间内放射一个光子返回到基态放射一个光子返回到基态分子的系间窜跃跃迁后，分子的系间窜跃跃迁后，就会发生快速的振动弛豫就会发生快速的振动弛豫到达第三激发单重态最低到达第三激发单重态最低振动能级上，以光子的形振动能级上，以光子的形式跃迁回到基态式跃迁回到基态（4）分子荧光的类型）分子荧光的类型:依据荧光物质所需的依据荧光物质所需的激发光源不同和吸能后放射荧光光谱的差激发光源不同和吸能后放射荧光光谱的差异异,分为分为:物理发光物理发光(物理物理/光致荧光）：荧光分子吸取光致荧光）：荧光分子吸取了光能了光能(如以如以X射线，紫外光，激光等为光射线，紫外光，激光等为光源的辐射能等源的辐射能等)而产生的荧光而产生的荧光;化学发光化学发光:通过分子与分子之间的化学反应通过分子与分子之间的化学反应所产生的化学能，在化学反应过程中释放所产生的化学能，在化学反应过程中释放能量而放射荧光能量而放射荧光;生物发光生物发光:通过生物体内的荧光酶与荧光物通过生物体内的荧光酶与荧光物质相互作用，在生物化学反应过程中所释质相互作用，在生物化学反应过程中所释放出来的光能放出来的光能.2.激发光谱和放射光谱激发光谱和放射光谱 任何荧光化合物的分子在吸取任何荧光化合物的分子在吸取能量和释放能量的过程中，都存在能量和释放能量的过程中，都存在着激发光谱和放射光谱。着激发光谱和放射光谱。激发光谱：荧光分子首先要从外界得激发光谱：荧光分子首先要从外界得到相应的能量，才能具备发光的基到相应的能量，才能具备发光的基本条件本条件,才有可能放射荧光。才有可能放射荧光。在选择最佳激发波长时，可通在选择最佳激发波长时，可通过测量分子的激发光谱来确定。过测量分子的激发光谱来确定。p放射光谱：放射光谱：分子放射荧光的特征波长比吸分子放射荧光的特征波长比吸取的特征波长长。取的特征波长长。p 放射光谱的形态与激发光谱极为相像放射光谱的形态与激发光谱极为相像,且呈镜像对称关系。且呈镜像对称关系。3.荧光量子产率与分子结构荧光量子产率与分子结构（1）荧光分子产生荧光的条件：）荧光分子产生荧光的条件：荧光分子必需具有与所照射的辐射频荧光分子必需具有与所照射的辐射频率相适应的结构，能吸取激发光供率相适应的结构，能吸取激发光供应的辐射能；应的辐射能；分子吸取了与本身特征频率相同能量分子吸取了与本身特征频率相同能量后，必需具有产生确定的荧光量子后，必需具有产生确定的荧光量子的实力。的实力。产生荧光量子的强弱可用荧光产生荧光量子的强弱可用荧光量子产率（也称荧光效率或量子效量子产率（也称荧光效率或量子效率）来表示：率）来表示：（2）分子结构与荧光的关系：）分子结构与荧光的关系：共轭效应：含有共轭效应：含有-*电子跃迁能级化合物的电子跃迁能级化合物的荧光最强。荧光最强。绝大多数能放射荧光的化合物，都是绝大多数能放射荧光的化合物，都是芳香族或杂环类化合物或者在它们的分子芳香族或杂环类化合物或者在它们的分子中含有芳香族或杂环类基团。中含有芳香族或杂环类基团。苯类化合物的对苯基化、间苯基化及苯类化合物的对苯基化、间苯基化及乙烯化作用能够增加苯分子的荧光强度。乙烯化作用能够增加苯分子的荧光强度。p分子的刚性平面结构：能产生较强荧光。分子的刚性平面结构：能产生较强荧光。这种结构可以削减分子的振动，分子与溶这种结构可以削减分子的振动，分子与溶剂或其他溶质分子相互之间的作用降低了，剂或其他溶质分子相互之间的作用降低了，这样更有利于荧光的放射（如芴和联二苯这样更有利于荧光的放射（如芴和联二苯的荧光效率分别为的荧光效率分别为1.0和和0.2；荧光素有很强；荧光素有很强的荧光，而酚酞没有荧光）。的荧光，而酚酞没有荧光）。p取代效应：给电子基团（如取代效应：给电子基团（如-OH，-OR，-NH2，p -CN，-NR等）能使荧光增加，得电子基团等）能使荧光增加，得电子基团（如（如-COOH，-C=O，-NO2，-NO及卤素离子及卤素离子等）能使荧光减弱等）能使荧光减弱三、仪器的结构与原理三、仪器的结构与原理1.荧光分光光度法定量分析基本原理荧光分光光度法定量分析基本原理 溶液的荧光强度和该溶液吸取光能的程度以溶液的荧光强度和该溶液吸取光能的程度以及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。2.荧光分光光度计的结构荧光分光光度计的结构 激发光源激发光源,激发单色器激发单色器,样品池样品池,放射单色放射单色器器,检测器及显示系统检测器及显示系统激发光源：要求能发出强度较大，连续稳定激发光源：要求能发出强度较大，连续稳定的光源。的光源。理论上理论上,放射荧光的强度取决于激发光放射荧光的强度取决于激发光源的强度源的强度.实际应用中选择光源的强度不能实际应用中选择光源的强度不能太强也不能太弱。太强也不能太弱。要依据荧光物质的性质选择合适光源要依据荧光物质的性质选择合适光源:对光敏感或放射荧光较强的物质选用较弱对光敏感或放射荧光较强的物质选用较弱光源光源,反之可选较强光源反之可选较强光源.测量荧光强度仪器：滤光片荧光分光光度计测量荧光强度仪器：滤光片荧光分光光度计和结构困难的精密荧光分光光度计。主要部件：和结构困难的精密荧光分光光度计。主要部件：激发光源激发光源:前者常用汞灯前者常用汞灯,后者常用氙灯后者常用氙灯(250700 nm).滤光片和单色器：前者接受两个滤光片滤光片和单色器：前者接受两个滤光片(激发滤光激发滤光片片/荧光滤光片荧光滤光片)；后者接受光栅作单色器。；后者接受光栅作单色器。样品池：低荧光的玻璃或石英制成，形态以散射光样品池：低荧光的玻璃或石英制成，形态以散射光较少的方形为宜。较少的方形为宜。检测器：阻挡层光电池检测器：阻挡层光电池(500600 nm最灵敏最灵敏)，缺点：，缺点：易疲惫，灵敏度低；光电倍增管检测器：灵敏度易疲惫，灵敏度低；光电倍增管检测器：灵敏度高，运用简洁，特殊适用于强度微弱光的测量。高，运用简洁，特殊适用于强度微弱光的测量。四、试验技术（影响荧光分析的因素）四、试验技术（影响荧光分析的因素）a.溶液的溶液的pH的影响：在溶液中，绝大多数的影响：在溶液中，绝大多数荧光物质都是以离子状态形式存在的，荧光物质都是以离子状态形式存在的，放射荧光的最佳条件是解离的荧光分子。放射荧光的最佳条件是解离的荧光分子。b.温度的影响温度的影响:温度上升，荧光物质产生的温度上升，荧光物质产生的荧光效率和荧光强度都会下降，反之。荧光效率和荧光强度都会下降，反之。c.溶剂的影响：荧光物质的荧光波峰位置溶剂的影响：荧光物质的荧光波峰位置和荧光强度与溶剂的介电常数有关。和荧光强度与溶剂的介电常数有关。d.不同溶剂对各种荧光物质发生荧光的不同溶剂对各种荧光物质发生荧光的影响程度是不同的，某些溶剂可使荧光影响程度是不同的，某些溶剂可使荧光物质形成协作物，某些溶剂可变更荧光物质形成协作物，某些溶剂可变更荧光物质的解离状态。物质的解离状态。d.激发光源的影响：光分解激发光源的影响：光分解:荧光化合物被强荧光化合物被强激发光照射会发生分解，引起荧光强度快速激发光照射会发生分解，引起荧光强度快速下降。所以，荧光分光光度计通常在激发光下降。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。让激发光照射样品池。e.器皿污染的影响：器皿内壁含极少量荧光物器皿污染的影响：器皿内壁含极少量荧光物质，会使测定结果造成偏差，最好用质，会使测定结果造成偏差，最好用30%硝硝酸清洗酸清洗。f.内滤效应的影响：在样品溶液中存在着杂质内滤效应的影响：在样品溶液中存在着杂质或测试样品池浓度太大引起荧光变弱的现象。或测试样品池浓度太大引起荧光变弱的现象。g.自吸取：样品浓度大，荧光分子吸取光能和自吸取：样品浓度大，荧光分子吸取光能和放射荧光的同时有部分重叠，而引起可检测放射荧光的同时有部分重叠，而引起可检测的荧光强度变弱。的荧光强度变弱。h.杂质吸取：样品溶液中存在能吸取激发光或杂质吸取：样品溶液中存在能吸取激发光或放射光能量的杂质，使检测到的光强度变弱。放射光能量的杂质，使检测到的光强度变弱。g.稀样品溶液的影响稀样品溶液的影响:h.氧化作用：荧光物质的稀溶液不如浓度氧化作用：荧光物质的稀溶液不如浓度高的溶液稳定，易发生氧化作用高的溶液稳定，易发生氧化作用(肾上腺肾上腺素，素，1 g/mL，100 g/mL)i.光分解：稀溶液相对于高浓度溶液更易光分解：稀溶液相对于高浓度溶液更易发生光分解，尤其对光较敏感的物质。发生光分解，尤其对光较敏感的物质。j.表面吸附：某些非待测的荧光物质吸附表面吸附：某些非待测的荧光物质吸附在比色皿内壁表面上，在分析过程中这在比色皿内壁表面上，在分析过程中这些荧光物质放射相应的荧光，干扰测定。些荧光物质放射相应的荧光，干扰测定。对稀溶液影响大。另外，表面吸附对不对稀溶液影响大。另外，表面吸附对不同溶剂吸附程度不同，有机溶剂表面吸同溶剂吸附程度不同，有机溶剂表面吸附更明显。附更明显。五、荧光检测技术的应用五、荧光检测技术的应用 依据发光机理，能吸取能量后以光子的形式释放能量的化合物都属荧依据发光机理，能吸取能量后以光子的形式释放能量的化合物都属荧光物质。光物质。发光方式分：发光方式分：自荧光物质自荧光物质(分子中含荧光发光基团或化学键分子中含荧光发光基团或化学键)外源荧光物质外源荧光物质(要与某些荧光物质或荧光燃料以共价键或离子键的形式结合要与某些荧光物质或荧光燃料以共价键或离子键的形式结合)分析方法分析方法:1、定量分析方法：定量分析方法：（1）标准曲线法）标准曲线法 （2）外标法（干脆比较法）：在确定浓度范围内，）外标法（干脆比较法）：在确定浓度范围内，选择一个合适的标准样品浓度，将其在荧光分光选择一个合适的标准样品浓度，将其在荧光分光光度计上测得的值与在同样条件下的未知样品的光度计上测得的值与在同样条件下的未知样品的值进行比较，得出未知样品的浓度。值进行比较，得出未知样品的浓度。未知样品浓度（未知样品浓度（mg/mL）=(A1/A2)c 式中，式中，A1为未知样品的荧光发光值，为未知样品的荧光发光值，A2为标准为标准样品的荧光发光值，样品的荧光发光值，c为标准样品浓度。为标准样品浓度。2、定性分析：依据荧光放射的波长和出现的峰位，、定性分析：依据荧光放射的波长和出现的峰位，确定物质结构的某些特征确定物质结构的某些特征.第三节第三节 分光光度检测技术分光光度检测技术a a、目视比色法、目视比色法 用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。法称为目视比色法。特点：设备简洁、操作简便；无需单色光；精确度不特点：设备简洁、操作简便；无需单色光；精确度不高。高。b b、分光光度计、分光光度计 基于被测物质的分子对光具有选择性吸取的特性基于被测物质的分子对光具有选择性吸取的特性而建立起来的分析方法。而建立起来的分析方法。包括：包括：分光光度检测技术分光光度检测技术（Chapter two spectrophotography)定义:分光光度检测技术是利用物质所特有的吸取光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。特点:灵敏、精确、快速和简便，在困难组分系统中，不须要分别，即能检测出其中所含的极少量物质。应用:生物化学探讨中广泛运用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。分光光度分光光度检测的分的分类分分光光光光度度检检测测的的分分类类红外分光光度检测红外分光光度检测:可见光分光光度检测可见光分光光度检测:紫外分光光度检测紫外分光光度检测:测定波长范围为测定波长范围为大于大于760 nm的红外光区的红外光区 测定波长范围为测定波长范围为400760 nm的可见光区的可见光区 测定波长范围为测定波长范围为200400 nm的紫外光区的紫外光区 一、分光光度一、分光光度计工作原理工作原理 （一）分光光度检测的光谱范围（一）分光光度检测的光谱范围 包包括括波波长范范围为400760 nm的的可可见光光区区和和波波长范范围为200400 nm的的紫紫外外光光区区。不不同同的的光光源源都都有有其其特特有有的的放放射射光光谱，因因此此可可接接受受不不同同的的发光光体体作作为仪器器的的光光源。源。钨灯灯的的放放射射光光谱：钨灯灯光光源源所所发出出的的400760nm波波长的的光光谱，光光通通过三三棱棱镜折折射射后后，可可得得到到由由红、橙橙、黄黄、绿、蓝、靛靛、紫紫组成成的的连续色色谱；该色色谱可可作作为可可见光分光光度光分光光度计的光源。的光源。氢灯灯的的放放射射光光谱：氢灯灯能能发出出185400 nm波波长的的光光谱，可作，可作为紫外光分光度紫外光分光度计的光源。的光源。（二）物质的吸取光谱（二）物质的吸取光谱 假如在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源放射光谱中某些波长的光因溶液吸取而消逝，这种被溶液吸取后的光谱称为该溶液的吸取光谱。不同物质的吸取光谱是不同的。因此依据溶液的吸取光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。用不同波长的单色光照射，测定吸光度，假如以用不同波长的单色光照射，测定吸光度，假如以波长波长为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为吸取曲线（为吸取曲线（A曲线）。曲线）。吸收曲线吸收曲线清楚地描述了物质对光的吸收情况。清楚地描述了物质对光的吸收情况。max=510 nm（1）不同物质吸取曲线的形态和吸取波长不同。）不同物质吸取曲线的形态和吸取波长不同。MnO4-531吸取曲线吸取曲线（2）同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物）同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物质不同浓度，其吸取曲线形态相像。质不同浓度，其吸取曲线形态相像。吸取曲线是特征的，可以供应物质的结构信息，作为吸取曲线是特征的，可以供应物质的结构信息，作为物质定性分析的依据之一；吸取曲线是定量分析中选物质定性分析的依据之一；吸取曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。择入射光波长的重要依据。当当光光线通通过某某种种物物质的的溶溶液液时，透透过的的光光的的强度度减减弱弱。因因为有有一一部部分分光光在在溶溶液液的的表表面面反反射射或或分分散散，一一部部分分光光被被组成成此此溶溶液液的的物物质所吸取，只有一部分光可透所吸取，只有一部分光可透过溶液。溶液。入射光入射光=反射光反射光 分散光分散光 吸取光吸取光 透透过光光 假假如如我我们用用蒸蒸馏水水(或或组成成此此溶溶液液的的溶溶剂)作作为“空空白白”去去校校正反射、分散等因素造成的入射光的正反射、分散等因素造成的入射光的损失，失，则：入射光入射光=吸取光吸取光 十十 透透过光光(三）分光光度计常用术语三）分光光度计常用术语C:测试溶液的溶液的浓度度 I :透透过光的光的强度度 I0 :空白校正后入射光的空白校正后入射光的强度度 T :透光率（透光率（I/I0）A:光吸取（光吸取（OD）L :比色杯光程比色杯光程吸光度吸光度A：物质对光的吸取程度。：物质对光的吸取程度。定义：定义：Alg（I0/It)A越大，表示对光的吸取越大，透过光越弱。越大，表示对光的吸取越大，透过光越弱。（四）依据原理：朗伯（四）依据原理：朗伯-比尔比尔定律（定律（Lambert Beer）1760年朗伯(Lambert)阐明白光的吸取程度和吸取层厚度的关系：Ab 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸取程度和吸取物浓度之间也具有类似的关系：Ac 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，比耳定律，Abc 朗伯朗伯比耳定律数学表达式：比耳定律数学表达式：Alg（I0/It)=b c 式式中中：A，吸吸光光度度，无无量量刚刚；b，液液层层厚厚度度(光光程程长长度度)，cm；c，溶溶液液的的浓浓度度，mol L-1；(epsilon)称称为为摩摩尔尔吸吸光光系系数数，Lmol-cm-1，仅仅与与入入射射光光波波长长、溶液的性质及温度溶液的性质及温度有关，与有关，与浓度无关浓度无关。上上式式表表明明：当当一一束束单单色色光光通通过过溶溶液液时时，其其吸吸光光度度与与溶溶液浓度和宽度的乘积成正比液浓度和宽度的乘积成正比。T T T T、A A A A、c c c c间的关系：间的关系：间的关系：间的关系：A A lglg（I I0 0/I It t)=-=-lg lg T T=b cb c 透光度透光度(透光率透光率)T)T：透过光和入射光强度之比，即：透过光和入射光强度之比，即T=It/I0 100%T=It/I0 100%T T越大，表示对光的吸取越小。越大，表示对光的吸取越小。朗伯朗伯-比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件单色光单色光 应选用应选用 max处或肩峰处测定处或肩峰处测定.稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间作用增浓度增大，分子之间作用增加加.吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系,应限制条件应限制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等).吸光度具有吸光度具有加和性：加和性：在多组分体系中，吸光度具有加和性，在多组分体系中，吸光度具有加和性，即：即：A（总）（总）A1+A2+An=1b c+2b c+nb c(五）五）分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括5个基本部件：光源、单色器、吸取池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:分光光度计的基本部件分光光度计的基本部件 光光 源源:分光光度分光光度计上常用的光源有两种：上常用的光源有两种：钨丝灯或灯或氢灯，在灯，在可可见光区、近紫外光区和近光区、近紫外光区和近红外光区常用外光区常用钨丝灯作灯作为光源；在紫光源；在紫外光区多运用外光区多运用氢灯。灯。单色器：把混合光波分解色器：把混合光波分解为单波波长光的装置。在分光光的装置。在分光光度光度计中多用棱中多用棱镜或光或光栅作作为色散元件。色散元件。吸取池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、石吸取池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用来盛被英或熔凝石英制成，用来盛被测的溶液。在低于的溶液。在低于350 nm350 nm的紫外光的紫外光区工作区工作时，必需接受石英池或熔凝石英池。，必需接受石英池或熔凝石英池。吸取池（比色皿）必需与光束方向垂直。此外，吸取池（比色皿）必需与光束方向垂直。此外，每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都误差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在运用前务必彻底会显著地影响其透光性，因此在运用前务必彻底清洗。清洗。检测器器：常常用用光光电池池、光光电管管和和光光电倍倍增增管管三种。三种。测量量仪表表：一一般般常常用用的的紫紫外外光光和和可可见光光分分光光光光度度计有有3种种测量量装装置置，即即电流流表表、记录器器和和数数字字示示值读数数单元元。现代代的的仪器器常常附附有有自自动记录器，可自器，可自动扫描出吸取曲描出吸取曲线。（六）运用分光光度法测定样品溶液浓（六）运用分光光度法测定样品溶液浓度的计算方法度的计算方法n n标准曲线法（常用）标准曲线法（常用）n n标准管法标准管法 n n标准系数法标准系数法 n n回来分析法回来分析法其方法和步骤是：其方法和步骤是：其方法和步骤是：其方法和步骤是：1 1）配制一组浓度不同的标准溶液）配制一组浓度不同的标准溶液）配制一组浓度不同的标准溶液）配制一组浓度不同的标准溶液(c1(c1、c2)c2)；2 2）在确定波长下，分别测定其吸光度）在确定波长下，分别测定其吸光度）在确定波长下，分别测定其吸光度）在确定波长下，分别测定其吸光度(A1(A1、A2)A2)。3 3）以以以以A A为为为为纵纵纵纵坐坐坐坐标标标标，浓浓浓浓度度度度c c为为为为横横横横坐坐坐坐标标标标，绘绘绘绘制制制制曲曲曲曲线线线线，得得得得到到到到一一一一条通过原点的直线，称为标准曲线（条通过原点的直线，称为标准曲线（条通过原点的直线，称为标准曲线（条通过原点的直线，称为标准曲线（A-cA-c曲线）。曲线）。曲线）。曲线）。4 4）用用用用完完完完全全全全相相相相同同同同的的的的方方方方法法法法和和和和步步步步骤骤骤骤测测测测定定定定待待待待测测测测溶溶溶溶液液液液的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度AxAx，从标准曲线上找出对应的浓度，从标准曲线上找出对应的浓度，从标准曲线上找出对应的浓度，从标准曲线上找出对应的浓度cxcx值（值（值（值（Ax Ax cx cx）。）。）。）。标准曲线法标准曲线法Axcx 空白空白 标准溶液标准溶液 待测溶液待测溶液Blank Standard Sample Samplec1c2c3c4cxc0标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线留意：留意：用比色法测定待测样品时，操作条件应与用比色法测定待测样品时，操作条件应与标准曲线相同标准曲线相同721-分光光度计分光光度计 1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。分钟。2.将灵敏度开关调至将灵敏度开关调至“1”档（若零点调整器调不到档（若零点调整器调不到“0”时，需选用较高档。）时，需选用较高档。）3.依据所需波长转动波长选择钮。依据所需波长转动波长选择钮。4.将空白液及测定液分别倒入比色杯将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。外壁，放入样品室内，