结核病实验室检查的临床意义优秀PPT.ppt

结核分枝杆菌试验 室检测方法 主要内容 一、结核杆菌的病原学基础 二、结合分支杆菌全球的流行状况三、结核杆菌的试验室检测方法及临床应用一、一、结核病的病原学基核病的病原学基础结核杆菌属：核杆菌属：一一类瘦瘦长略略带弯曲，有弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属呈分枝状的杆菌，本属细菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus），），细菌体内含有分枝菌酸，菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有胞壁含有大量脂大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、反抗力和致与分枝杆菌的染色性、反抗力和致病性等病性等亲密相关。密相关。本属本属细菌已菌已经被被鉴定的有定的有70多种，可分多种，可分为三大三大类：结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌；分枝杆菌；按生按生长速度可分速度可分为三三类，即，即缓慢生慢生长菌、快速生菌、快速生长菌和不能培育菌三种菌和不能培育菌三种类型型结核分枝杆菌群结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包括人结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti），前三种对人类治病，其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌刚好精确的诊断结核病，有效地限制传染源，对预防结核病至关重要。结核病结核病试验室检查试验室检查细菌学检查细菌学检查免疫学检查免疫学检查分子生物学检查分子生物学检查涂片染色镜检涂片染色镜检分枝杆菌分别培育分枝杆菌分别培育分支杆菌药敏试验分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定分枝杆菌菌种鉴定最原始最基础的检测方法最原始最基础的检测方法涂片染色镜检涂片染色镜检抗酸染色的原理分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质。包围在肽聚糖的外面，所以分支杆菌一般不易着色，须要经过加热或是延长染色时间来促使其着色。但分支杆菌中的分支菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。涂片染色涂片染色镜检临床价床价值 适用于多种适用于多种标本；本；操作操作简便，价格低廉。便，价格低廉。涂片涂片镜检的的临床床应用用 一、确一、确诊涂阳涂阳结核病及开放性核病及开放性结核核2份痰份痰标本干脆涂片抗酸杆菌本干脆涂片抗酸杆菌镜检阳性；阳性；1份痰份痰标本干脆涂片抗酸杆菌本干脆涂片抗酸杆菌镜检阳性阳性+影像影像学学检查符合活符合活动性肺性肺结核表核表现。涂片涂片镜检的的临床床应用用二、肺二、肺结核治核治疗评估的主要依据之一估的主要依据之一治愈：治愈：涂阳肺涂阳肺结核患者完成核患者完成规定定疗程，程，连续2次涂次涂片片结果阴性，其中果阴性，其中1次是治次是治疗末的涂片。末的涂片。治治疗失失败：新涂阳患者治新涂阳患者治疗第第5个月末或个月末或疗程程结束束时，痰涂片，痰涂片检查阳性，涂阴肺阳性，涂阴肺结核患者治核患者治疗过程程中任何中任何1次痰菌次痰菌检查阳性，均阳性，均为治治疗失失败。缺点：缺点：不能区分不能区分结核分枝杆菌和非核分枝杆菌和非结核分支杆菌核分支杆菌不能区分死菌跟活菌。不能区分死菌跟活菌。结核杆菌暴露于异烟核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失，某些条件会失去抗酸性，出去抗酸性，出现假阴性。假阴性。检测灵敏度灵敏度较低（低（104-105 个个细菌菌/毫升）。毫升）。分枝杆菌分别培育 结核菌培育仍是目前诊断结核病的金标准尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用,是鉴定是否为活菌的牢靠方法传统的固态培育法 须要46周才能检测到结核菌的生长而且阳性率也只有30-40 ；特异性差各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。快速培育法:检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜干脆视察、变色液体培育基等。快速培育法阳性的报告时间或许是13周左右，比传统的固态培育法快，但是仪器价格太昂贵。确确诊结核病核病 1份痰份痰标标本干脆涂片抗酸杆菌本干脆涂片抗酸杆菌镜检镜检阳性阳性+1份份痰痰标标本本结结核分枝杆菌培育阳性即可确核分枝杆菌培育阳性即可确诊诊。痰涂片阴性，肺部影像学痰涂片阴性，肺部影像学检查检查符合活符合活动动性性肺肺结结核影像学表核影像学表现现+1份痰份痰标标本本结结核分枝杆核分枝杆菌培育阳性菌培育阳性结核菌培育临床价值结核菌培育临床价值用于耐多用于耐多药结核核疗效判定效判定治愈：治愈：（1）患者完成）患者完成疗程，且在程，且在疗程的后程的后12个月，至少最个月，至少最终5次痰培育（每次次痰培育（每次间隔至少隔至少30天）天）连续阴性。阴性。（2）如出）如出现1次痰培育阳性，其后痰培育（次痰培育阳性，其后痰培育（间隔至隔至少少30天）最少天）最少连续3次阴性。次阴性。失失败：治治疗的最的最终12个月，个月，5次痰培育中有两次或两次以次痰培育中有两次或两次以上阳性；或者在最上阳性；或者在最终的的3次，培育中有任何一次是次，培育中有任何一次是阳性。阳性。分分别培育的培育的优点点敏感性敏感性较干脆涂片法高，理干脆涂片法高，理论上上10-10010-100条菌条菌/毫升可毫升可检出阳性；出阳性；特异性特异性较干脆涂片法高，可以从菌落生干脆涂片法高，可以从菌落生长速速度、色素度、色素产生初步推断非生初步推断非结核分枝杆菌；核分枝杆菌；分分别出具有活力的出具有活力的纯培育物，培育物，为进一步一步药敏敏试验供供应基基础。分分别培育的缺点培育的缺点需需时长，依据接种量的大小，一般，依据接种量的大小，一般2-82-8周才能得到肉眼可周才能得到肉眼可见菌落。菌落。结果受果受标本保存运本保存运输时间、培育基成分和、培育基成分和质量、前量、前处理方法等影响，理方法等影响，操作操作较干脆涂片法困干脆涂片法困难，需，需经严格培格培训 ，对试验室要求也是室要求也是较高。高。成本是干脆涂片法的成本是干脆涂片法的7-87-8倍。倍。结核病结核病试验室检查试验室检查细菌学检查细菌学检查免疫学检查免疫学检查分子生物学检查分子生物学检查涂片染色镜检涂片染色镜检分枝杆菌分别培育分枝杆菌分别培育分支杆菌药敏试验分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定分枝杆菌菌种鉴定体液免疫学检查体液免疫学检查细胞免疫学检查细胞免疫学检查体液免疫学体液免疫学检查（血清学（血清学检查）结核抗体核抗体测定定结核抗原核抗原测定定循循环免疫复合物免疫复合物测定定 血清学诊断血清学诊断血清学血清学诊断技断技术优势：是一种：是一种对疾病疾病进行早期行早期诊断的志向方法。断的志向方法。无需活无需活细胞培育和特殊胞培育和特殊仪器器设备操作操作简便便结果果显示快速示快速目前用于血清学目前用于血清学诊断的主要方法断的主要方法:酶联免疫吸附免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗斑点金免疫渗滤法法(DIGFA)免疫印迹法免疫印迹法(Western Blotting)等等等等2011年年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议运用血清学方法作为结核杆菌的诊断试验因此不建议运用血清学方法作为结核杆菌的诊断试验1。血清学检测的评价血清学检测的评价缘由：由于所用的测定方法、运用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异缘由：由于所用的测定方法、运用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。较大，并且缺乏可比性。WHO对来自不同国家的对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培育相比，种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培育相比，这些试剂盒检测的灵敏度为这些试剂盒检测的灵敏度为1%60%，特异度为，特异度为5399%1。结核病核病细胞免疫学胞免疫学检查结核菌素皮肤试验蛋白水平分子诊断:-干扰素释放试验（IGRA)迟发型细胞超敏反应迟发型细胞超敏反应1 1）方法：）方法：1:2000 OT1:2000 OT或或PPDPPD液液0.10.1毫升毫升(5(5单位单位)，左前臂屈侧中部左前臂屈侧中部皮内注射，皮内注射，484872h72h测量皮测量皮肤肤硬结硬结的直径。的直径。结核菌素核菌素试验（PPD试验）2 2）推断标准：）推断标准：阴性阴性4mm4mm弱阳性弱阳性5-9mm5-9mm阳性阳性10-19mm10-19mm，强阳性强阳性20mm20mm或局部出现水泡或局部出现水泡与坏死与坏死3)3)结核菌素试验的意义结核菌素试验的意义阴性：无结核菌感染；不能解除结核感染。阴性：无结核菌感染；不能解除结核感染。阳性：曾有结核感染，并不确定现在患病。阳性：曾有结核感染，并不确定现在患病。强阳性：活动性结核病可能强阳性：活动性结核病可能 A、变态反应尚未建立；、变态反应尚未建立；B、免疫抑制如应用皮质、免疫抑制如应用皮质激素或养分不良等激素或养分不良等 PPD PPD所含抗原所含抗原为为致病性分枝杆菌、致病性分枝杆菌、环环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结结果受到卡介苗接种及其他果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异性分枝杆菌感染的影响，特异性较较差。差。当出当出现现免疫功能低下免疫功能低下时时可出可出现现假阴性假阴性结结果，敏感性低。果，敏感性低。免疫力正常的阴性有确定意免疫力正常的阴性有确定意义义。强强阳性有确定意阳性有确定意义义。有。有结结核核变态变态反反应应、淋巴、淋巴结结核核强强阳性多。阳性多。经济经济、简简便，可以用于流行病学大便，可以用于流行病学大规规模的模的筛查筛查和普和普查查，但存在着明，但存在着明显显的缺陷。的缺陷。PPDPPD试验临床价值试验临床价值结核感染者体内存在特异的效应结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测）。因此，检测效应效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜藏感染者的诊断。淋巴细胞可用于结核病或结核潜藏感染者的诊断。由于效应由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本土的结核诊利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本土的结核诊疗指南中。疗指南中。目前应用的进口目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚）澳大利亚Cellestis公司的公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英国）英国Oxford Immunotec公司的公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:-干扰素释放试验（IGRA)T-SPOT.TB原理原理T-SPOT.TB是以是以拥拥有有专专利的特异抗原（利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），），通通过过酶酶联联免疫斑点技免疫斑点技术术（ELISPOT）检测检测受受试试者体内是否存者体内是否存在在结结核效核效应应T淋巴淋巴细细胞，从而推断目前胞，从而推断目前该该受受试试者是否感染者是否感染结结核核杆菌（杆菌（现现症感染）的新方法。症感染）的新方法。结结核杆菌特异抗原：核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培育培育滤滤液蛋白液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）T-SPOT.TB临床性能指床性能指标 特异性特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（和卡介苗（BCG）无交叉反应）无交叉反应 美国美国FDA数据：特异性数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度灵敏度基本不受免疫力低下基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率高的检出率 美国美国FDA数据：灵敏度数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)试验结果的说明试验结果的说明 阴性阴性结果果提示患者体内不存在提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效核杆菌特异的效应T细胞。胞。假阴性假阴性结果：果：感染感染阶段不同；段不同；少数免疫系少数免疫系统功能不全患者功能不全患者 阳性阳性结果果提示患者体内存在提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效核杆菌特异的效应T细胞，患者存在胞，患者存在结核感染。但是否是活核感染。但是否是活动性性结核病，需核病，需结合合临床症状和其它床症状和其它检测指指标综合推断。合推断。假阳性假阳性结果：果：4种种环境分枝杆菌感染境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪（堪萨斯）、斯）、M.szulgai（苏氏）、氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）方法学的优点方法学的优点检测特异性的提高特异性的提高帮助帮助临床区分卡介苗接种和床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的境分枝杆菌感染引起的“假阳假阳性性”，避开了，避开了临床的无效用床的无效用药检测灵敏度的提高灵敏度的提高有利于有利于临床床对结核病的早核病的早发觉、早治、早治疗，避开了疾病的，避开了疾病的传播与播与扩散散快速快速48小小时出出结果果方法学的方法学的局限局限不能区分活不能区分活动性性TB与潜藏感染与潜藏感染不能不能够提示提示临床患者的病床患者的病变部位，部位，须要要结合合临床的推断床的推断目前目前还不能不能够依据斑点数量的多少来推断患者依据斑点数量的多少来推断患者是活是活动性性结核病或是潜藏感染者核病或是潜藏感染者不适合用于不适合用于结核病患者治核病患者治疗的的疗效效监测检测收收费高（高（600-700元元/次）次）体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验活动性结核病通过有效的抗结活动性结核病通过有效的抗结核治疗后，结核杆菌载量下降，效应核治疗后，结核杆菌载量下降，效应T T细胞数量会细胞数量会随之削减，所以理论上随之削减，所以理论上IGRAIGRA结果应从阳性转变为结果应从阳性转变为阴性，但临床实践中发觉阴性，但临床实践中发觉IGRAIGRA结果转阴率特别低。结果转阴率特别低。20122012年发表的一篇年发表的一篇metameta分析中指出，分析中指出，T-SPOT.TBT-SPOT.TB在在结核病患者抗结核治疗后转阴率为结核病患者抗结核治疗后转阴率为5.71%-13.93%5.71%-13.93%，说明，说明IGRAIGRA在评价抗结核治疗方面作用是有限的。在评价抗结核治疗方面作用是有限的。Chiappini E,Fossi F,Bonsignori F,Chiappini E,Fossi F,Bonsignori F,et al.Utility of interferon-release et al.Utility of interferon-release assay results to monitor anti-tubercular assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children.Clin treatment in adults and children.Clin Ther,2012,34:1041-1048.Ther,2012,34:1041-1048.IGRA在评价抗结核治疗中的作用是有限的在评价抗结核治疗中的作用是有限的结核病结核病试验室检查试验室检查细菌学检查细菌学检查免疫学检查免疫学检查分子生物学检查分子生物学检查涂片染色镜检涂片染色镜检分枝杆菌分别培育分枝杆菌分别培育分支杆菌药敏试验分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定分枝杆菌菌种鉴定体液免疫学诊断体液免疫学诊断细胞免疫学诊断细胞免疫学诊断聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）DNADNA测序测序DNADNA探针技术探针技术基因芯片技术基因芯片技术分子生物学检测方法近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏试验供应了极大的便利，可将诊断时间从几周降低到几天甚至是几个小时。探讨、应用报道较多的结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。实时荧光PCR技术本试验室所运用的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）接受单管单人份的分装技术，操作过程特别简便；并引入荧光检测技术，简化了检测步骤，并且整个扩增及扩增后检测都无需打开扩增管盖，从根本上克服了PCR遗留污染。荧光探针PCR检测技术综合了PCR扩增的高敏感性、探针杂交的高特异性及荧光能量转移的实时跟踪特性，使检测的精确性大大提高，并可充分保证检测的稳定性及重复性。结核杆菌PCR检测的临床意义1.在痰菌阴性结核快速诊断有重要临床应用价值。在临床工作中，痰菌阴性，经临床综合分析后诊断为肺结核的患者，约占肺结核患者的60%-70%。有报道指出痰菌阴性的肺结核患者，假如未经抗结核治疗，经过1-3年的随访，将有40%-60%的患者发展为菌阳甚至更典型的肺结核。所以获得病原学的诊断至关重要结核杆菌PCR检测的临床意义2012年发表在中国防痨杂志中的一篇文章的探讨指出在476例菌阴肺结核病患者中，PCR法检出116例阳性，检测的灵敏度为24.4%而菌阳肺结核患者的检测灵敏度为97.0%结核杆菌PCR检测的临床意义2、PCR法可以作为临床痰涂片和痰培育的补充，为临床诊断和治疗供应帮助涂片阳性并不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌，这两者的治疗是有很大的差异的，NTM对于常用的抗结核药常常都是无效的，所以对于涂片阳性的标本，很有必要在在做MTB-DNA的检测，进一步确认是否是真的MTB的感染。结核杆菌PCR检测的临床意义3.可作为结核性关节炎和泌尿系统结核早期诊断的一个牢靠指标。118 例疑似结核病患者,其中关节炎患者 52 例,泌尿系感染患者 66 例,应用 FQ-PCR 技术分别检测患者关节腔积液和尿液中的 TB-DNA,并与抗酸染色法的检出率比较。结果 52 例关节炎患者中,确诊结核性关节炎患者36 例,TB-DNA 阳性 22 例,22 例全部为确诊病例,阳性率61.1%。抗酸染色的阳性只有2例,阳性率5.6%;66 例泌尿系统疾病患者中,确诊泌尿系结核患者52例,TB-DNA 阳性 32例,32 例全部为确诊病例,阳性率为 61.5%,抗酸染色的阳性只有 4例,阳性率 7.7%。结论 应用 FQ-PCR 技术检测患者关节腔积液和尿液中的 TB-DNA,具有高度敏感性和特异性,可作为结核性关节炎和泌尿系统结核早期诊断的一个牢靠指标。2010年发表在中国防痨杂志结核杆菌PCR检测的临床意义4、PCR用于临床疗效视察比涂片、培育好用，对估计有可能复发的病例有确定的帮助有些耐药菌或患者经化疗后痰排菌可能转化为型结核分枝杆菌，抗酸染色不能有效检测，而检测细菌，不受其表型变更影响，所以较抗酸染色法对 有更强的检出实力，能更有效地发觉传染源、降低漏诊率，是早期诊断肺结核比较好的指标。L 型的结核分支杆菌是形成慢性传染源的主要缘由,也是结核病恶化、复发的细菌学根源。所以对年老体弱、合并有其它机体疾病、痰中含菌量多、肺部结核病变广泛、有空洞存在、化疗期满、微生物学检查(涂片加培育)阴转但 PCR 仍持续阳性的患者,应实行接着亲密视察,或同时考虑更改治疗方案或延长治疗时间及随访时间等做法。美国CDC建议：在同时获得核酸检测和涂片结果后，依据其结果不同可分为4种状况1.对于核酸检测和抗酸杆菌涂片结果均为阳性的患者，需高度怀疑结核病，在等待培育结果的同时，可以起先抗结核治疗。2.对于核酸检测阳性，而涂片阴性的患者，在等待培育结果的同时，需结合临床其他证据来综合推断是否起先抗结核治疗，同时也可在次采集标本进行核酸检测，如2次或以上标本的结合杆菌核酸阳性，则可高度怀疑肺结核。3.对于核酸检测阴性而涂片阳性的患者，如2次涂片阳性而核酸检测均阴性患者，而且未检测到PCR抑制剂，则患者可能是感染非结核分枝杆菌。4.对于核酸检测和涂片检测均为阴性的患者，在等待培育结果的同时，也须要依据临床其他资料确定是否起先抗结核治疗。因为美国CDC的数据显示，对于涂片阴性、培育阳性的肺结核患者，目前的核酸检测的灵敏度为50%-80%不等。PCR检测的优点敏感性和特异性都是优于培育法跟涂片法检测的速度快适用于多种标本，如通过对痰、脑脊液、关节腔积液、尿液、胸腹水等标本中结核杆菌的PCR检测，快速诊断肺结核、结核性关节炎、泌尿系结核、结核性脑膜炎、结核性胸腹膜炎等检测费用比较合理（101元/份）。要留意临床假阳性的问题PCR检测的是病原体核酸，不管结核分枝杆菌是否为活菌的细菌，PCR均能检出，因此，在经抗生素治疗一个疗程后，必需两周后才能做PCR，避开临床出现假阳性总结：涂片简洁快速但阳性率较低、难以区分结核和非结核分枝杆菌培育为金标准，但需时较长血清学试验检测结核抗原或抗体不太志向干扰素释放试验能较好地为临床服务但是价格昂贵，须要结合传统的方法综合分析荧光PCR检测结核分枝杆菌具有较好的敏感性和特异性，需结合传统方法综合分析谢谢 谢谢 大大 家家