QC微生物培训.pptx

微生物实验室管理（一） 发生菌液（或培养液）污染台面或地面时，应立即以0.1新洁尔灭溶液或其它消毒液倾复其上，至少30分钟后再行洗擦 工作衣帽口罩等受到菌液污染时，应立即脱去，高压灭菌后洗涤 如有传染性培养物污染手部，应先用酒精棉球拭去，再浸入0.1新洁尔灭溶内片刻，再用肥皂及清水彻底洗刷干净。微生物实验室管理（二） 带菌的实验用品应浸泡在消毒液内48小时后取出，或121，30分钟高压灭菌后进行洗涤。废弃带菌培养物应121，30分钟高压灭菌后再行处理。 微生物限度检验室：生物限度检验室每周进行清洁消毒并填写微生物限度检验室清洁记录。消毒剂为0.1新洁尔灭溶液或84消毒液，每月轮换使用，清洁工具与其他区域的清洁工具严格分开。每次操作前用消毒液或酒精棉球擦拭工作面及一些可能污染的死角。用紫外灯杀菌至少30分钟，并填写紫外灯使用记录。微生物实验室管理（三） 洁净实验室的要求： 室内墙壁光滑，应尽量避免死角，以便于洗刷消毒。 应保持密闭、防尘、洁净、干燥。进行操作时尽量避免走动。 室内设备简单，禁止放置杂物。 工作台、地面和墙壁可以用0.1新洁尔灭溶液或0.5 84消毒液擦洗消毒。微生物实验室管理（三） 洁净实验室内的温度应控制在18-26，相对湿度最好在40%-60%。 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不低于10000级，局部洁净度为100级。 操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间应保持相对正压，不低于5Pa。常用仪器使用注意事项（一） 培养箱：取放物品应快速进行，并随手关闭箱门以维持恒温；定期检查加湿用水水位，注意加水。每周要断电消毒一次。 超净工作台：在每次操作前后用消毒液擦拭操作台及可能的死角，然后要打开层流净化装置30min。操作者应穿着洁净工作服、工作鞋、戴口罩。 高压灭菌锅：每次使用前都要检查水位；根据不同的物品选择相应的灭菌程序。当屏幕显示“灭菌完成，可以开门”同时蜂鸣器叫时，才可以开门取出物品。提篮不可以超载，试管，玻璃瓶等的灭菌，应是开口向下竖直放置。培养基灭菌时，装载量不超过2/3容积，避免外溢。 常用仪器使用注意事项（二）检定菌管理（一） 人员要求：菌种设双人、双锁保管。用受过专业培训，有足够的菌种保存经验。 检定菌的申购：根据检验品种的需要，菌种保管员现提出购买检定菌的申请，并写明购买菌种名称、标准编号、数量，注明要求购回时间，并交QC主管、品管部经历批准。 检定菌的接收：菌种保管员应详细核对购买回菌种与申购单中内容一致后，方可签字接收，并填写阳性菌购置记录。检定菌管理（二） 检定菌的保存、传代： 1 菌种应于210专用冰箱中贮存，并有每天的运行记录。 2 每月定期对菌种进行传代，传代时须核对编号、代数、传代日期、所用培养基，并记录。 3 控制传代次数。 一般传代次数不得超过5代。检定菌管理（三） 检定菌传代编号方法： 1 编号由阳性菌简写字母+代数+支数组成，中间以“”连接。 2 阳性菌的简写字母：大肠埃希菌：Y ，黑曲霉：H ，金黄色葡萄球菌：JY，枯草芽孢杆菌：KY ，白色念珠菌：BY ，沙门菌：SY 3 保存形式： 在阳性菌的简写字母后加以汉子说明。保存方式有两种，琼脂斜面保存和半固体加封石蜡，斜面保存不用加以说明，如为半固体在阳性菌的简写字母后加写“半”字。 4 首次购进的检定菌规定为0代，以购进时编号表示；第一次传代后变为第一代，代数“1”，第二次传代后变为第二代，代数“2”，依次类推。培养基管理 培养基的配置：按使用说明书上的要求操作。配置培养基时用纯化水。填写配制记录。在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期， 培养基的保存： 1环境条件：210为宜，不得冻结。 2保存时限：自配培养基应在2周内用完。 3琼脂平板最好现配，在冰箱内密闭保存不应超过一周。 4培养基的再融化：只允许再融化一次，4550水浴中保存不超过8小时。 5培养基的处理：被污染的培养基要经高温灭菌后在进行处理。微生物限度检验方法（一） 通常微生物限度检验的方法有平皿法、培养基稀释法、薄膜过滤法等。 1.1.平皿法平皿法 根据菌数报告法规则取相应稀释级的供试液 1ml，置直径 90mm 的无菌平皿中，注入 1520ml 温度不超过 45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备 2 个平板。微生物限度检验方法（二） 2. 2. 稀释法稀释法：取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平血;控制菌检 时，可加大增菌培养基的用量。微生物限度检验方法（三） 3.薄膜过滤法薄膜过滤法 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于 0.45m，直径一般为 50mm， 若采用其它直径的滤膜， 冲洗量应进行相应的调整。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。 使用时， 应保证滤膜在过滤前后的完整性。 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。供试液经薄膜过滤后， 若需要用冲洗液冲洗滤膜， 每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml。 计数方法的验证 （一） 验证方法验证方法 验证试验分4组，至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 和 50100cfu 试验菌， 分别注入平皿中， 立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备 2个平皿， 按平皿法测定其菌数。 薄膜过滤法计数时， 取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入 50100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 计数方法的验证 （二） （2）菌液组 测定所加的试验菌数。 （3）供试品对照组 取规定量供试液， 按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时， 应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时， 可用相应的稀释液替代供试品， 加入试验菌， 使最终菌浓度为每1ml 供试液含 50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。计数方法的验证 （三） 结果判断结果判断 在 3 次独立的平行试验中， 稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。若试验组的菌数回收率均不低于 70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70%，应建立性方法，消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 计数方法的验证 （四） 稀释剂对照组的菌落回收率稀释剂对照组的菌落回收率= 试验组的菌落回收率试验组的菌落回收率=稀释剂对照组的平均菌落数稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数菌液组的平均菌落数试验组的平均菌落数试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数菌液组的平均菌落数100%100% 菌数报告规则（一） 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于 300cfu、 霉菌平均菌落数小于 100cfu 的平板计数作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。当仅有一个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数；当有2个或2个以上稀释剂的菌落数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1时，以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 菌数报告规则 （二） 控制菌检查 控制菌检查是用于检查某些特定微生物（控制菌或其他致病菌），规定按一次检出结果为准，不准复试。控制菌应在专门的阳性菌实验室进行。 控制菌：大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，梭菌，白色念珠菌。培养基适用性检查（一） 检查指标：促生长能力，抑制能力，指示能力 培养基灭菌后在能取出的前提下，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留，固体培养基灭菌活融化后，融化状态放置下不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境2-25保存，但不应超过21天。 固体琼脂培养基融化后再使用应不超过一次。培养基适用性检查（二） 结果判断：结果判断：被检培养基上的平均菌落数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态，大小应和对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。